实验室检查梅毒有在暗视野显微镜下查找梅毒螺旋体方法、梅毒血清学检查法和病理切片银染色法。
暗视野显微镜检查是自皮肤病灶处或肿大的淋巴结取标本后进行检查，适宜于一期梅毒和二期梅毒。二期梅毒可取扁平湿疣或阴部湿丘疹处的分泌物作为标本，以提高阳性率。如果在暗视野显微镜下发现梅毒螺旋体，即可以确诊。暗视野检查法不适于从口腔取标本，因为口腔中正常存在的致密螺旋体容易混淆诊断。
梅毒血清学阳性的出现迟于硬下疳的发生，一般在硬下疳出现1～4周后才出现阳性。因此早期检查如果为阴性，应在1周后复查。二期梅毒时，血清学的阳性率可达95%以上。至晚期梅毒，非梅毒螺旋体抗原试验多为阳性，也可能为阴性，梅毒螺旋体抗原试验为阳性。晚期梅毒还可以做脑脊液检查。
病理切片银染色法可以显示内脏器官和皮肤损害中的梅毒螺旋体。
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