HLA-DRB1等位基因与慢性支气管炎和支气管哮喘的可比性研究
中华医学遗传学杂志 1999年第6期第16卷 论著
作者：王崇刚 彭则 李建强 刘卓拉 宋满景
单位：王崇刚 李建强 刘卓拉 宋满景 030001 山西医科大学第二医院呼吸内科；彭则 同济医科大学同济医院呼吸内科
关键词：HLA-DRB1；慢性支气管炎；支气管哮喘；顺序特异引物聚合酶链反应
【摘要】 目的 研究慢性支气管炎和支气管哮喘患者的HLA-DRB1等位基因的异同。方法 采用顺序特异引物聚合酶链反应技术，检测山西汉族74例慢性支气管炎及64例支气管哮喘患者HLA-DRB1等位基因频率，并与正常人群进行比较分析。结果 慢性支气管炎组HLA-DRB1·1201/1202基因频率明显增高(P＜0.01),为24.32%；支气管哮喘组HLA-DRB1·1501/1502基因频率明显增高(P＜0.05)，为23.44%；其它等位基因在3组间无显著性差异。结论 在山西汉族人群中，HLA-DRB1·1201/1202与慢性支气管炎相关联，而HLA-DRB1·1501/1502与支气管哮喘相关联。
Comparative study of HLA-DRB1 allele in patients with chronic bronchitis and bronchial asthma
WANG Chonggang*, PENG Ze, LI Jianqiang, LIU Zhuola, SONG Manjing.* Department of Respiratory Diseases, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan, 030001 P.R. China.Email:Wang chong gang@263.net
【Abstract】 Objective To make a comparative study of HLA-DRB1 allele frequencies in the cases of chronic bronchitis and bronchial asthma.Methods The authors investigated 74 patients with chronic bronchitits and 64 patients with bronchial asthma from among the Han people in Shanxi province. Polymerase chain reaction/single specific primers(PCR/SSP) technique was used for HLA-DRB1 typing, and the patients' data were compared with the normal controls'.Results The frequency of HLA-DRB1·1201/1202(24.32%) was significantly increased in the chronic bronchitis group (P＜0.01), and the frequency of HLA-DRB1·1501/1502(23.44%) was significantly increased in the bronchial asthma group (P＜0.05).The frequencies of other DRB1 alleles were not significantly increased in these groups.Conclusion The results indicate that HLA-DRB1·1201/1202 allele is associated with chronic bronchitits and HLA-DRB1·1501/1502 allele is associated with bronchial asthma in the patients among the Hans in Shanxi province.
【Key words】 HLA-DRB1 Chronic bronchitis Bronchial asthma Polymerase chain reaction/Sequence specific primers
慢性支气管炎和支气管哮喘均属呼吸道的炎症性疾病，目前认为是由环境因素和基因易感性相互作用而形成的。由于它们在某些方面的相似性，使得国内外学者多年来从组织形态改变至功能变化等诸多方面对其进行了比较性研究［1，2］。我们应用顺序特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction/sequence specific primers,PCR/SSP)技术，检测山西籍汉族人HLA-DRB1等位基因频率，从免疫遗传学角度探讨慢性支气管炎及支气管哮喘的异同。
1 材料与方法
1.1 对象 慢性支气管炎组：74例慢性支气管炎患者经结合临床病史体征、胸片及肺功能检查确诊；支气管哮喘组：64例支气管哮喘患者，根据临床病史、体征并结合支气管激发试验阳性等确诊；正常对照组：104名健康人。3组均为山西籍汉族随机抽样个体。
1.2 主要试剂及仪器 Taq聚合酶及dNTPs(Promega)，HLA-DRB1序列特异性引物(德国Essen大学合成)，紫外分光光度计(Shimadzu,Ur-120-02)，PCR仪(Perkin-Elmer TC1)。
1.3 模板制备及引物 按改进的盐析法从外周血淋巴细胞提取基因组DNA。用紫外分光光度计测定DNA含量及纯度，其中A260nm/A280nm值须在1.6～1.8(吸光度A旧称光密度OD)。HLA-DRB1等位基因特异性引物(SSP)针对DRB1第2外显子区域的多态性设计SSP(表1)，所扩增的产物具有等位基因特异性，分型结果和血清学方法测得的HLA-DRB1表型具有对应关系［3］。
表1 DRB1等位基因特异性引物
Tab 1 The sequence specific primers of DRB1 allele
| Primers
(引物5′-) |
Sequence
(序列) |
3′-Primers
(3′-引物) |
Sequence
(序列) |
PCR product size
(PCR产物大小) |
DRB primers specificity
(DRB引物特异性) |
| 5′01 |
5′TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3′ |
3′047 |
5′CTGCACTGTGAAGCTCGCAC3′ |
255bp |
0101-0102 |
| |
|
3′048 |
5′CTGCACACTGTGAAGCTCTCCA3′ |
255bp |
| 5′01 |
5′TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3′ |
3′10 |
5′CCCGCTCGTCTTCCAGGAT3′ |
130bp |
0103 |
| 5′02 |
5′TCCTGTGGCAGCCTAAGAG3′ |
3′01 |
5′CCGCGCCTGCTCCAGGATT3′ |
197bp |
1501-1502 |
| 5′02 |
5′TCCTGTGGCAGCCTAAGAG3′ |
3′02 |
5′AGGTGTCCACCGCGGCG3′ |
213bp |
1601-1602 |
| 5′03 |
5′TACTTCCATAACCAGGAGGAGA3′ |
3′03 |
5′TGCAGTAGTTGTCCACCCG3′ |
151bp |
0301-0302 |
| 5′06 |
5′GACGGAGCGGGTGCGTA3′ |
3′048 |
5′CTGCACACTGTGAAGCTCTCCA3′ |
217bp |
0301 |
| 5′03 |
5′TACTTCCATAACCAGGAGGAGA3′ |
3′047 |
5′CTGCACTGTGAAGCTCTCAC3′ |
189bp |
0302,1302,1305,
1402,1403,1409 |
| 5′04 |
5′GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA3′ |
3′047 |
5′CTGCACTGTGAAGCTCTCAC3′ |
260bp |
0401-0411 |
| |
|
3′048 |
5′CTGCACACTGTGAAGCTCTCCA3′ |
260bp |
| 5′07 |
5′CCTGTGGCAGGGTAAGTATA3′ |
3′079 |
5′CCCGTAGTTGTGTCTCGACAC3′ |
232bp |
0701-0702 |
| 5′08 |
5′ACTACTCTACGGGTGGTGTT3′ |
3′05 |
5′CTGCAGTAGGTGTCCACCAG3′ |
214bp |
0801-0806 |
| 5′09 |
5′GTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTT3′ |
3′079 |
5′CCCGTAGTTGTGTCTCGACAC3′ |
236bp |
0901 |
| 5′10 |
5′CGGTTGCTGGAAAGACGCG3′ |
3′047 |
5′CTGCACTGTGAAGCTCTCAC3′ |
204bp |
1001 |
| 5′05 |
5′GTTCTTGGAGTACTCTACGTC3′ |
3′06 |
5′CTGGCTGTTCCAGTACTCCT3′ |
176bp |
1101-1105 |
| 5′08 |
5′ACTACTCTACGGGTGGTGTT3′ |
3′08 |
5′CTCTGTGAAGCTCTCCACAG3′ |
248bp |
1201-1202 |
| 5′03 |
5′TACTTCCATAACCAGGAGGAGA3′ |
3′10 |
5′CCCGCTCGTCTTCCAGGAT3′ |
130bp |
1301-1302 |
| 5′05 |
5′GTTCTTGGAGTACTCTACGTC3′ |
3′045 |
5′TGTTCCAGTACTCGGCGCT3′ |
171bp |
1303-1305 |
| 5′03 |
5′TACTTCCATAACCAGGAGGAGA3′ |
3′17 |
5′CCCGCCTGTACTTCCAGGAA3′ |
200bp |
1305 |
| 5′05 |
5′GTTCTTGGAGTACTCTACGTC3′ |
3′11 |
5′TCTGCAATAGGTGTCCACCT3′ |
334bp |
1401,1404,1405,
1407,1408 |
| 5′08 |
5′ACTACTCTACGGGTGGTGTT3′ |
| 5′03 |
5′TACTTCCATAACCAGGAGGAGA3′ |
3′12 |
5′TCCACCGCGGCCCTCC3′ |
140bp |
1402,1404,1306,
1306,1409 |
| 5′04 |
5′GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA3′ |
3′19 |
5′CTGTTCCAGTCTCCGCAG3′ |
188bp |
1410 |
| 5′52.1 |
5′TTTCTTGGAGCTGCGTAAGTC3′ |
3′13 |
5′CTGTTCCAGGATCGGCGA3′ |
171bp |
DRB3 |
| 5′52.2 |
5′GTTTCTTGGAGCTGCTTAAGTC3′ |
3′14 |
5′GCTGTTCCAGTACTCGGCAT3′ |
173bp |
0101-0301 |
| 5′53 |
5′GAGCGAGTGTGGACCTGA3′ |
3′048 |
5′CTGCACTGTGAAGCTCTCCA3′ |
213bp |
DRB40101 |
| 5′51 |
5′GTTTCTTGCAGCCAGGATAAGTA3′ |
3′01 |
5′CCGCGCCTGCTCCAGGAT3′ |
198bp |
DRB5 |
| |
|
3′16 |
5′CCGCGGCGGCCTGTCT3′ |
207bp |
0101-0202 |
1.4 PCR/SSP方法 SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，从而通过PCR反应特异性地扩增该基因片段。每一PCR反应管中含有待测基因组DNA100ng、Taq酶0.5U、dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)各200μmol、SSP2pmol。PCR反应条件为：预变性94℃5分钟，变性94℃50秒，退火65℃1分钟，延伸72℃1分钟，共30个循环。
1.5 特异性扩增产物的检测 PCR扩增产物加样至含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中，在电压10～15V/cm凝胶条件下电泳20分钟，经紫外透射下泳道中见明显DNA条带为阳性。第1～20泳道的引物各为有DRB1等位基因特异性或组特异性；第21～23泳道的引物各为HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5基因特异性，它们分别与不同的DRB1等位基因关联［4］。
1.6 统计学处理 采用χ2检验，P＜0.05。
2 结果
74例慢性支气管炎、64例支气管哮喘患者及104名正常人HLA-DRB1等位基因频率及显著性分析结果见表2。慢性支气管炎组HLA-DRB1·1201／1202基因频率为24.32%，与其余两组比较，χ2=17.27，P＜0.01；支气管哮喘组HLA-DRB1·1501／1502基因频率为23.44%，与其余两组比较，χ2=8.88，P＜0.05；其它等位基因频率在3组间无显著性差异。
表2 中国山西汉族慢性支气管炎、支气管哮喘患者与正常人HLA-DRB1等位基因频率
Tab 2 HLA-DRB1 allele frequencies in chronic bronchitis,bronchial asthma and normal controls of Shanxi Han nationality
| Lines
(泳道) |
HLA-DRB1
allele
(等位基因) |
Normal controls
(正常对照组) |
Patients with chronic bronchitis
(慢性支气管炎组) |
Patients with bronchial asthma
(支气管哮喘组) |
| N1 |
GF(%)
n=208 |
AF(%)
n=104 |
N2 |
GF(%)
n=148 |
AF(%)
n=74 |
N3 |
GF(%)
n=128 |
AF(%)
n=64 |
| 1 |
0101-0102 |
6 |
2.9 |
5.8 |
3 |
4.1 |
8.1 |
1 |
1.6 |
3. |
1 |
| 2 |
0103 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| 3 |
1501-1502 |
22 |
10.6 |
21.2 |
8 |
10.8 |
21.6 |
15 |
23.4 |
46. |
9* |
| 4 |
1601-1602 |
7 |
3.4 |
6.7 |
4 |
5.4 |
10.8 |
2 |
3.1 |
6. |
3 |
| 5 |
0301-0302 |
8 |
3.9 |
7.7 |
2 |
2.7 |
5.4 |
2 |
3.1 |
6. |
3 |
| 6 |
0301 |
10 |
4.8 |
9.6 |
2 |
2.7 |
5.4 |
3 |
4.7 |
9. |
4 |
| 7 |
0302-1302-1305 |
2 |
1.0 |
1.9 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| |
1402-1403-1409 |
| 8 |
0401-0414-1401 |
20 |
9.6 |
19.2 |
6 |
8.1 |
16.2 |
5 |
7.8 |
15. |
6 |
| 9 |
0701-0702 |
29 |
13.9 |
27.9 |
7 |
9.5 |
18.9 |
7 |
10.9 |
21. |
9 |
| 10 |
0809-0806 |
14 |
6.7 |
13.5 |
4 |
5.4 |
10.8 |
3 |
5.0 |
9. |
4 |
| 11 |
0901 |
26 |
12.5 |
25.0 |
10 |
13.5 |
27.0 |
7 |
10.9 |
21. |
9 |
| 12 |
1001 |
10 |
4.8 |
9.6 |
2 |
2.7 |
5.4 |
4 |
6.3 |
12. |
5 |
| 13 |
1101-1105 |
8 |
3.9 |
7.7 |
2 |
2.7 |
5.4 |
2 |
3.1 |
6. |
3 |
| 14 |
1201-1202 |
17 |
8.2 |
16.4 |
18 |
24.3 |
48.7* |
5 |
7.8 |
15. |
6 |
| 15 |
1301-1302-1306 |
11 |
5.3 |
10.6 |
2 |
2.7 |
5.4 |
3 |
4.7 |
9. |
4 |
| 16 |
1303-1304-1305 |
3 |
1.4 |
2.9 |
1 |
1.4 |
2.7 |
1 |
1.6 |
3. |
1 |
| 17 |
1305 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| 18 |
1401-1404-1405 |
9 |
4.4 |
8.7 |
3 |
4.1 |
8.1 |
2 |
3.1 |
6. |
2 |
| |
1407-1408 |
| 19 |
1402-1305-1306 |
1 |
0.5 |
1.0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| 20 |
1410 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| blank control(空白) |
5 |
2.4 |
4.8 |
0 |
0 |
0 |
2 |
3.1 |
6. |
2 |
*GF：gene frequency(基因频率)，AF：Antigen frequency(抗原频率) P＜0.05；N1，N2，N3 mean the amount of HLA-DRB1 allele in normal controls, patients with chronic bronchitis and bronchial asthma(N1、N2、N3分别为正常人、慢性支气管及支气管哮喘患者的等位基因数量)
3 讨论
慢性支气管炎和支气管哮喘在病理及病理生理方面存在着一定的差异［1］。通过支气管肺泡灌洗发现慢性支气管炎随过氧化酶含量增高，IL-6的分泌缺乏；而支气管哮喘IL4、IL-5、GM-CSF及嗜酸粒细胞阳离子蛋白分泌增高［2，5］。近年Balbi等［6］发现慢性支气管炎急性发作期，其支气管肺泡灌洗液中GM-CSF的含量也明显增高。从免疫遗传学角度来分析理解上述异同可能更有意义。已知在HLA复合体众多基因中HLA-DRB多态性最为复杂，迄今为止已发现DRB1有160个以上的等位基因［4］，HLA-DR抗原主要分布于抗原提呈细胞表面，参与抗原提呈过程，HLA抗原在免疫应答中的调节作用主要由其结构多态性及在细胞表面表达水平所决定。因此，我们研究了HLA-DRB1在慢性支气管炎和支气管哮喘中的多态性。结果发现，山西汉族人群中，慢性支气管炎的HLA-DRB1·1201/1202基因频率明显增高，而支气管哮喘则为HLA-DRB1·1501/1502基因频率明显增高。近年来国外有关HLA基因型，主要是HLA Ⅰ类抗原与慢性支气管炎关联有所报道，如HLA-Bw54在日本籍弥慢性细支气管炎患者中明显增高［7］；Anagnostopoulou等［8］发现希腊籍慢性支气管炎患者HLA-A1和HLA-B17明显升高。这些结果间的差异可能与实验对象不同种族有关。无论HLA Ⅰ或HLA Ⅱ类基因在慢性支气管炎患者中分布的显著性变化均可影响HLA Ⅰ或HLA Ⅱ类抗原在细胞表面的活性，进而影响呼吸道的免疫炎性反应，说明HLA抗原与慢性支气管炎有关联。我们的研究证实山西汉族人群中，慢性支气管炎与HLA-DRB1·1201/1202关联，而支气管哮喘与HLA-DRB1·1501/1502关联。这一结果可能对今后研究慢性支气管炎及支气管哮喘不同的发病机理提供新的线索。
本课题受山西省留学归国人员基金(1996第2号)资助
参考文献
1 Jeffery PK. Comparative morphology of the airways in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 150∶6-13.
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4 Robbins F, Hurley CK, Tang T, et al. Diversity associated with the second expressed HLA-DRB locus in the human population. Immunogenetics, 1997, 46∶104-105.
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7 Sugiyama Y, Kodoh S, Maeda H, et al.Analysis of HLA antigens in patients with diffuse panbronchiolitis. Am Rev Respir Dis, 1990, 141∶1459.
8 Anagnostopoulou U, Toumbis M, Konstantopoulos K, et al. HLA-A and -B antigens in chronic bronchitis. J Clin Epidemiol, 1993, 46(12)∶1413-1416.
(收稿：1999-01-18 修回：1999-04-15)
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