腺苷受体激动剂在豚鼠实验性哮喘中的作用
中国病理生理杂志 2000年第2期第16卷 论著
作者：李荣 张珍祥 彭则
单位：（武汉同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室，湖北 武汉 430030）
关键词：豚鼠；哮喘；动物，实验；苯异丙基腺苷
［摘 要］ 目的：研究腺苷受体激动剂R-苯异丙基腺苷(N6-phenyl-2R-isopropyl-adenosine,R-PIA)对实验性哮喘豚鼠气道阻力、肺顺应性的影响。方法：复制豚鼠实验性哮喘动物模型，给予R-PIA 5 mg/mL的生理盐水雾化吸入，观察气道阻力、肺顺应性的变化，以及肺泡灌洗液中NO-x、环-磷酸腺苷(cAMP)、环一磷酸鸟苷(cGMP)、肿瘤坏死因子(TNF)含量的变化。结果：给予R-PIA雾化吸入后较哮喘组气道阻力增加（P＜0.05），肺顺应性下降(P＜0.05)，肺泡灌洗液中NO-x、cAMP、cGMP、TNF水平下降,而TNF含量无明显变化。NO哮喘组为2.39±0.05，R-PIA组为1.34±0.03(P＜0.05)，cAMP哮喘组为1.62±0.04，R-PIA组为0.79±0.02(P＜0.05),cGMP哮喘组为0.47±0.09，R-PIA组为0.25±0.02(P＜0.05)，TNF哮喘组为45.18±17.26，R-PIA组为43.62±14.29(P＞0.05)。结论：R-PIA有收缩气道的作用，并与肺泡灌洗液中NO-x、cAMP、cGMP水平下降有关。
［中图分类号］ R562.2＋5 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)02-0135-04
Effects of inhaling N6-phenyl-2R-isopropyl-adenosine on the experimental asthmatic guinea-pigs
LI Rong, ZHANG Zhen-xiang, PENG Ze
(Respiratory Diseases Research Laboratory, Department of Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China)
［Abstract］ AIM：To evaluate the role of inhaling N6-phenyl-2R-isopropyl-adenosine (R-PIA) on the airway resistance and pulmonary compliance of experimental asthmatic guinea-pigs.METHODS: Experimental model of asthmatic guinea-pigs were made. Inhaling R-PIA 5 mg/mL( 5 mg R-PIA in 1 mL 0.9% saline). The airway resistance， pulmonary compliance and NO-x， cyclic adenosine monophosphate (cAMP)， cyclic guanosine monophosphate (cGMP)，tumor necrosis factor (TNF) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were observed.RESULTS: Compared with asthma group, after inhaling R-PIA, the airway resistance of experimental asthmatic guinea-pigs increased (P＜0.05), but the pulmonary compliance decreased (P＜0.05). So did the NO-x and cAMP, cGMP in BALF (P＜0.05), TNF in BALF had no change (P＞0.05).CONCLUSION: Inhaling R-PIA could constrict the airway of experimental asthmatic guinea-pigs.
［MeSH］ Guinea-pigs; Asthma; Animals, laboratory; Phenylisopropyladenosine
腺苷为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)代谢产物，局部缺血缺氧时增加，其在心血管的作用已有广泛而深入的研究，腺苷具有扩张微血管、增加冠脉血流量、降低缺血再灌注损伤等作用。它在支气管哮喘中的作用已有报道［1］。它对气道阻力、肺顺应性、炎症介质的作用如何呢?目前还未见报道。我们通过观察实验性哮喘豚鼠吸入腺苷受体激动剂R-PIA，旨在探讨R-PIA在支气管哮喘豚鼠中的作用。
材 料 和 方 法
一、动物选择与准备
Hartly系豚鼠34只，雌雄不拘，体重(300±50)g，本校实验动物中心提供。取24只按文献方法［2］复制豚鼠支气管哮喘的动物模型。实验前两周给予10％卵清蛋白生理盐水腹腔内注射，常规喂养。正常对照组10只在同一实验室内未作任何处理，同一条件下喂养。取致敏的动物，给予20％乌拉坦5 mg/kg腹腔内注射，行气管插管，然后用直径约1 mm的硅胶管行食管插管。完成后将准备好的动物移入有两孔的封闭的有机玻璃盆中，一孔经过食道插管和气管插管，使气道与外界大气相通，保持气道插管通畅,维持自主呼吸,将食道插管另一端连于压力换能器(Gloud-13-4615,美国)，描记于四导生理记录仪上(Gloud-13-4615,美国)。另一孔接一压力换能器(Gloud-13-4615,美国)用体积描记仪的方法将动物呼吸胸廓起伏的变化引起空气压力的变化描记于Gloud四导生理记录仪上。将食道压的变化作为胸内压的变化,空气压力的变化作为潮气量的变化，并将潮气量经时间微分的变化描记下来，作为流速的变化。
二、气道阻力，肺顺应性的测定
完成以上动物准备后，在Gloud四导仪上同步记录用药前各组数据的变化。
VT：密闭盒子里空气压力的变化,代表动物潮气量的变化,单位:mL。
△P:食道压的变化，代表胸内压的变化，单位：kPa。
△V:空气压力变化经微分的变化，代表气流速度的变化，单位：mL/s。
(一)对照组 10只雾化吸入0.9％生理盐水5 min后，立即记录st、 5 min、10 min、20 min以上各指标的变化。哮喘组用预先致敏的豚鼠24只，1％卵清蛋白生理盐水雾化吸入5 min后随机分为两组，每组12只。(二)哮喘组 不吸入R-PIA,记录诱发哮喘后st 、5 min、10 min、20 min各指标的变化。(三)哮喘＋吸入R-PIA组 诱发哮喘后立即记录上述各指标的变化(即st的变化)，紧接着吸入P-PIA 5 mg/mL 5 min仍记录诱发哮喘后5 min、10 min、20 min以上各指标的变化。以上P、VT、V在Gloud四导仪上均采用同步记录。肺顺应性(C)和气道阻力(R)根据公式计算：C=VT/△P 单位:mL-1/kPa。
R=△P/△V，单位：kPa·mL-1.s-1
三、肺泡灌洗液NO-x、环一磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、环一磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)水平的测定
处死动物，取整个气管和肺组织，用生理盐水5 mL进行灌注，回收肺泡灌洗液，-70℃冷藏检测NO-x、cAMP、cGMP、TNF的含量。NO-x和TNF测定采用北京邦定生物医学公司NO-x和TNF测试盒。cAMP、cGMP测定采用上海中医药大学同位素室［125I］-cAMP RIA Kit, ［125I］-cGMP RIA Kit放免药盒.具体操作见说明书。
四、HE染色、病理切片
各组取一肺标本，用4％甲醛灌注,固定,做HE染色,病理切片，了解气道炎症情况。
五、统计方法
实验数据用平均数±标准差(
±s)表示，统计检验采用t检验。
结 果
一、气道阻力，肺顺应性的变化
哮喘组较对照组1％卵清蛋白生理盐水雾化吸入5 min后立即有气道阻力增加(P＜0.05)，肺顺应性下降(P＜0.05)。哮喘＋吸入R－PIA组给予R-PIA 5 mg/mL雾化吸入5 min,发现较哮喘组气道阻力进一步增加(P＜0.05)，肺顺应性进一步下降(P＜0.05)(表1)。
二、肺泡灌洗液NO-x、cAMP、cGMP、TNF水平的变化
哮喘组肺泡灌洗液中NO-x、cGMP、TNF高于对照组（P＜0.05），cAMP低于对照组（P＜0.05）。哮喘＋吸入R-PIA组TNF高于对照组（P＜0.05），cAMP低于对照组（P＜0.05），而NO-x、cGMP无明显变化（P＞0.05）。哮喘＋吸入R-PIA组NO-x、cAMP、cGMP低于哮喘组(P＜0.05)。而TNF则无明显变化(P＞0.05)(表2)。
三、病理切片结果
HE染色病理切片显示动物致喘后气道上皮下有大量的炎性细胞浸润，哮喘＋R-PIA吸入组则炎性细胞浸润无明显变化。
表1 R-PIA吸入对实验性哮喘豚鼠气道阻力和肺顺应性的影响
Tab 1 Effect of inhaling R-PIA on the pulmonary compliance and airway resistance of experimental asthmatic guinea-pigs (±s)
| |
Control group(n=10) |
Asthma group(n=12) |
Asthma and with R-PIA Inhaled group(n=12) |
| C |
R |
C |
R |
C |
R |
| Before |
2.148±0.031 |
0.080±0.06 |
2.150±0.020 |
0.080±0.003 |
2.146±0.102 |
0.079±0.003 |
| |
|
|
↓OA 5min |
|
↓OA 5min |
| After St |
2.146±0.306 |
0.079±0.001 |
1.901±0.959* |
0.095±0.002* |
1.899±0.306 |
0.095±0.001 |
| |
|
|
|
|
↓R-PIA 5min |
| 5 min |
2.197±0.051 |
0.074±0.001 |
1.836±0.031* |
0.124±0.017* |
1.542±0.510# |
0.051±0.001# |
| 10 min |
2.208±0.420 |
0.076±0.002 |
1.991±0.020* |
0.111±0.005* |
1.803±0.204# |
0.121±0.008# |
| 15 min |
2.208±0.714 |
0.079±0.002 |
2.146±0.301 |
0.080±0.003 |
2.052±0.010 |
0.087±0.003 |
*P＜0.05，vs control group; # P＜0.05，vs asthma group；C：compliance; R:resistance
表2 R-PIA对实验性哮喘豚鼠肺泡灌注液中NO-x、cAMP、cGMP、TNF含量的影响
Tab 2 Effects of R-PIA on the production of NO-x,cAMP,cGMP TNF in bronchoalveolar
lavage fluid of experimental asthmatic guinea pigs (±s)
| |
Control group(n=10) |
Asthma group(n=12) |
Asthma and with R-PIA inhaled group(n=12) |
| NO-x (μmol/L) |
1.23±0.02 |
2.39±0.05* |
1.34±0.03# |
| cAMP(pmol/mL) |
2.45±0.05 |
1.62±0.04* |
0.79±0.02# |
| cGMP(pmol/mL) |
0.23±0.01 |
0.47±0.09* |
0.25±0.02# |
| TNF(pg/mL) |
6.69±2.57 |
45.18±17.26* |
43.62±14.29 |
*P＜0.05， vs control group；# P＜0.05，vs asthma group
讨 论
致敏动物诱发哮喘后气道阻力增加，肺顺应性下降，气道上皮下炎症细胞增加,表明哮喘动物模型成功。哮喘＋吸入R-PIA组行雾化吸入R-PIA 5 mg/mL后，气道阻力进一步上升，肺顺应性进一步下降，并持续到雾化吸入后10 min,与哮喘组差异有显著意义。表明R-PIA有气道收缩作用。
NO半衰期短，在体内很快氧化失活，最终生成亚硝酸盐、硝酸盐（NO-x）。它们为NO在体内稳定的代谢产物，可间接反应NO水平，所以对血液、体液中的NO测定实际为对其终代谢产物NO-x的测定。哮喘组肺泡灌洗液NO-x、TNF、cGMP水平测定显著高于对照组，cAMP水平下降显著低于对照组。哮喘＋吸入R-PIA组NO-x、cAMP、cGMP水平下降，显著低于哮喘组，而TNF无明显差异。哮喘＋吸入R-PIA组cAMP水平下降，TNF水平升高，较对照组差异有显著性意义，而NO-x 、cGMP含量无明显差异。说明哮喘豚鼠肺中TNF、NO-x、cGMP升高而cAMP下降。
NO在支气管哮喘中的作用已有研究,支气管哮喘患者呼出气体NO是增加的。认为是诱导型的一氧化氮合酶(iNOS)受炎症等刺激合成增加,具有代偿意义。NO作为内皮源性舒张因子的主要成份具有舒张气道的作用［3］。我们发现哮喘组较对照组NO-X增加，但哮喘＋吸入R-PIA组肺泡灌洗液中较哮喘组NO-Ｘ下降，与对照组无明显差异。R-PIA使气道NO生成减少的机制还不十分清楚。
cAMP为细胞内的第二信使，具有稳定支气管平滑肌膜电位，抑制组胺,慢反应物质释放的作用,哮喘动物肺组织cAMP是降低的［4］。已有研究发现培养的犬气道上皮细胞中NO的释放伴随细胞内cAMP增加，钙离子增加，认为NO释放与cAMP有密切联系［5］。本研究发现R-PIA可以使哮喘豚鼠肺泡灌洗液cAMP和NO-Ｘ下降,推测是R-PIA对A1受体的激动，即抑制腺苷酸环化酶导致cAMP下降，认为cAMP反过来对NO的释放可能有一定作用［6］。
cGMP也为细胞内第二信使，传统的观点认为cGMP可增加肥大细胞生物活性物质释放，使支气管收缩引起哮喘。在实验性哮喘豚鼠肺组织cGMP是增加的，我们研究的结果与之相似。哮喘吸入R-PIA组较哮喘组BALF中cGMP下降(P＜0.05),与对照组比较(P＞0.05)。自从对NO的深入研究后，人们改变了对cGMP的看法，研究发现NO可透过细胞膜激活鸟苷酸环化酶，使cGMP增加，cGMP通过多种途径，抑制胞内Ca2+的增加，舒张平滑肌。推测cGMP在本研究中升高、下降的机制可能不同，所起的作用也不一样，具体的细节还值得进一步深入探讨。
TNF为支气管哮喘重要的炎性介质，它可以激活其它细胞因子如血小板活化因子、白介素等的分泌、释放，加重气道炎症和气道平滑肌的收缩，研究发现它与哮喘的严重度平行［7］。已有研究发现腺苷受体激动剂具有抑制单核细胞TNF生成的作用［8］，但我们研究发现哮喘吸入R-PIA对肺泡灌洗液中TNF含量影响不大，可能为实验动物和方法不同引起。
腺苷为ATP代谢产物5'AMP在细胞内经5核苷酸酶脱磷酸而生成,腺苷为能量代谢的中间产物，半衰期小于10秒，为缺血缺氧局部产生的一种调节性物质。研究发现支气管哮喘患者吸入腺苷可立即导致支气管收缩反应，FEV1下降［1］。并发现腺苷、5AMP均可引起气管、支气管收缩反应［9］。本研究也发现实验性哮喘豚鼠吸入腺苷类似物R-PIA可进一步降低肺顺应性，增加气道阻力，认为R-PIA是诱发哮喘的一种支气管收缩性介质。嘌呤受体有P1和P2两种受体，腺苷对P1受体的激动效应远强于P2受体，P1受体又可进一步分为A1和A2受体，A1受体激活有抑制腺苷酸环化酶的作用，A2受体具有激活腺苷酸环化酶的作用，R-PIA其作用A1大于A2，即具有抑制腺苷酸环化酶的作用，腺苷为缺血、缺氧时的代谢产物，支气管哮喘时肺部有缺氧的可能，腺苷产生是增加的，它可降低cAMP的浓度加重气道收缩的程度，A1、A2受体拮抗氨茶碱，低浓度即可对抗腺苷引起的支气管收缩［1］。
总之，我们的研究发现吸入R-PIA可以降低肺顺应性，提高气道阻力，降低肺泡灌洗液内NO-x、cAMP、cGMP含量,而对TNF无明显影响，认为R-PIA为一种致喘物质。腺苷在支气管的作用与在冠脉、微血管中的作用截然不同，其作用机制值得进一步探讨。
参 考 文 献
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［收稿日期］ 1998-12-04 ［修回日期］ 1999-06-17
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