中国人哮喘易感性与染色体5q31～33区连锁关系的初步研究

中华儿科杂志 1998年第12期第0卷 论著

作者：赵华　杜晓娟　林丽渊　姜晶　徐平池　陈虹　陈育智

单位：100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室［赵华(研究生)、杜晓娟、陈虹(通讯联系人)］，哮喘防治中心（姜晶、陈育智）；福建省诏安县人民医院（林丽渊、徐平池）

关键词：哮喘；多态现象(遗传学)；染色体；连锁(遗传学)

　　【摘要】　目的　获得中国人相关位点的资料，确定中国人哮喘易感性与染色体5q31～33区域的连锁关系。方法　采集32个哮喘家系共192份样品，并取39个正常无关个体为对照；用同位素掺入的聚合酶链反应(PCR)法扩增多态性遗传标记D5S436和D5S393，通过受累同胞配对法进行D5S436和D5S393与哮喘和高血清总IgE的连锁分析。结果　正常对照分析：D5S436共获得9个等位片段，多态性信息含量（PIC）为0.803，杂合度（HET）为0.823，D5S393共有11个等位片段，PIC为0.892，HET为0.898，表明两个位点均属于高度多态性的遗传标记。连锁分析：D5S436与哮喘呈连锁状态（P＜0.05）,D5S393与哮喘没有连锁关系；D5S436和D5S393与高血清总IgE都没有显示连锁关系。结论　染色体5q31～33区可能存在与中国人哮喘易感基因相关的1个或多个位点，是进行中国人哮喘易感基因研究的重要候选区域之一。

　　A preliminary study on linkage between genetic susceptibility to asthma and chromosome 5q31-33 region in Chinese population　Zhao Hua^*, Du Xiaojuan, Lin Liyuan, et al. ^*　Department of Biochemistry and Immunology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020

　　【Abstract】　Objective　To accumulate data on the asthma-related loci in Chinese population and determine whether genetic susceptibility to asthma was linked to the chromosome 5q31-33 region.Methods　One hundred ninety-two samples from 32 families from Zhaoan county in Fujian province were collected. Specimens from 39 unrelated individuals were collected and used as normal controls. The polymorphic markers D5S436 and D5S393 were amplified by PCR incorporated with radioactive isotope. Linkage analysis was performed using the sib-pair method.Results　Nine alleles in D5S436 were obtained. The polymorphism information content (PIC) and heterozygosity of D5S436 was 0.803 and 0.823 respectively. There were 11 alleles in D5S393. The PIC and heterozygosity was 0.892 and 0.898, respectively. These data indicated that both were highly polymorphic markers and can be convincingly used in positional cloning. Significant evidence for linkage to asthma was observed with D5S436 （P＜0.05）but not with D5S393. No significant linkage of total serum IgE to D5S 436 or to D5S 393 could be identified.Conclusion　The preliminary results suggested that the region of chromosome 5q31-33 may contain one or more loci associated with the susceptibility to asthma in Chinese population. Therefore, it may still be a very attractive candidate region for further approach.

　　【Keywords】　Asthma　　Polymorphism (genetics)　　Chromosomes　　Linkage (genetics)

　　支气管哮喘具有遗传倾向，作为一个重要的多基因遗传病，已经成为国际上多基因遗传病研究的热点之一。近几年来在确定哮喘易感性的相关基因的研究中，通过进行全基因组DNA扫描和潜在候选基因确定两种技术手段，已经提出了几个可能的候选基因和染色体候选区域^［1～3］。其中染色体5q31～33区含有参与变态反应和哮喘炎症过程的大量调节因子基因群，是国际上最引人关注的染色体候选区域^［4，5］。本研究在全国90万儿童哮喘流行病学研究的基础上^［6］，在发病率最高（达5.6%）的福建省诏安县采集哮喘家系样本，选择染色体5q31～33区的两个多态性遗传标记进行实验分析，旨在获得中国人群样本在相关位点的资料，确定该区域与中国人哮喘易感性的连锁关系。

对象和方法

　　一、研究对象

　　1. 哮喘家系样本：于1996年4月和1997年1月先后两次在福建省诏安县人民医院医生的配合下，选取以哮喘患儿为先证者的核心家庭或三代家系为对象进行采样，所有受检个体在征得同意后，进行了几项测试：（1）根据国际间统一问卷诊断标准，了解患病情况及危险因素。（2）变应原皮肤点刺实验，共21种吸入性变应原。（3）肺功能测定，采用一秒用力呼气流量（FEV1.0）及峰流速测定。由于受当地条件限制，仅少数人做了组胺激发实验和肺功能测定。进行实验研究的哮喘家系共32个，血样192份，年龄分布范围在0.8～80岁之间。其中患者人数为101，患病百分率为52.3%；男性97人，患者人数为59，患病百分率为60.8%；女性95人，患者42人，占43.8%；男高于女，χ²=5.358, P＜0.05; 同胞配对数55个，患病同胞配对数为50个。

　　2. 正常对照组：在诏安地区采集19份血样，选自诏安县医院实习学生和医生。北京地区20份血样，取自我所实验室工作人员。所有对照均无哮喘史及典型过敏史，其中男性22人，女性17人，年龄分布在18～55岁之间。

　　二、实验方法

　　1. 主要试剂：聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增多态性遗传标记D5S436和D5S393的引物系根据文献^［7］，由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：

　　D5S436 CA引物　5′TATGTGCCAGGCATTACGCT-3′

　　GT引物　5′-GTCTCCACCCACAGCAGG-3′

　　D5S393 CA引物　5′-TTGCTACCTGNCCTTTCCTCT-3′

　　GT引物　5′-CATTCCTCATTCCTCATTCC-3′

　　Taq DNA聚合酶购自上海生物工程公司；Taq track sequencing system试剂盒、dNTP、蛋白酶K为Promega公司产品；［α-³²P］dATP购自亚辉公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自中国协和医科大学科技开发公司。

　　2. 血清总IgE水平的测定：采用双抗体夹心酶联免疫法，实验步骤参考试剂盒说明书进行。每次实验均作IgE工作标准曲线；每个样品均平行加入两个孔中，若两孔吸光度(A)值读数变异大于10%，则进行重复实验。鉴于不同人群的遗传背景及生活环境的差异，将诏安地区哮喘家系样本血清总IgE的均值定为正常值上限。

　　3. 多态性遗传标记的PCR：哮喘家系样品在当地置于4℃冰箱中，于72小时内低温运回北京，立即进行全血基因组DNA的提取。DNA的提取参考文献［8］，按照本实验室常规方法进行。简言之，用无菌双蒸水低渗溶解红细胞，以100 μg/ml蛋白酶K消化液悬浮白细胞，37℃消化过夜后，进行饱和酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，即可获得基因组DNA。D5S436和D5S393的PCR扩增采用同位素掺入法，在冰浴中配制PCR反应混合液，在12.5 μl反应体积中含DNA模板50ng, 引物0.1 μmol/L, MgCl₂ 1.5 mmol/L, dGTP、dCTP和dTTP各0.2 mmol/L, dATP 0.05 mmol/L, 并加入［α-³²P］dATP（370 MBq/ml）1 μl/100 μl反应体积，Taq DNA聚合酶0.625 U。待PCR仪预热至94℃，将混合液放在PCR仪上，变性3分钟后，开始循环。循环条件为：94℃、40秒，60℃、40秒，72℃、1分钟，共35个循环，最后延伸为72℃、10分钟。反应结束后加入含95%甲酰胺的终止液。

　　4. PCR产物的电泳分析及片段大小的判读：用含7 mol/L尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，样品经100℃变性5分钟后上样，恒功率60W, 电泳时间4～6小时，按常规方法固定干胶后，进行放射自显影。每块胶可进行两批样品上样，两次上样时间间隔30分钟；同一家庭成员的样品尽量在一起上样。正常人D5S436和D5S393的PCR扩增片段大小是参照已知的M13和pUC18的DNA序列分析结果获得的。用Taq track sequencing system通过双脱氧末端终止法对M13和pUC18进行序列分析，将测序反应产物与PCR产物同时进行电泳，既可精确判读出PCR扩增片段的大小。从已知的正常无关个体中选出3个个体，其多态性遗传标记等位片段大小分别位于不同的片段长度范围，且能完全分开，以此为对照，与哮喘家系样品同时上样进行电泳分离，判定哮喘家系样品的PCR扩增片段长度。

　　三、统计学分析

　　根据正常对照组的资料，计算多态性遗传标记的多态性信息含量（polymorphism information content, PIC）和杂合度（heterozygosity, HET）。

　　用世代一致性（identical by decent, IBD）和状态一致性（identical by state, IBS）通过受累同胞配对法，采用PPAP软件（哈尔滨医科大学流行病教研室研制）分别将同胞对的D5S436和D5S393的等位片段结果，以一一对应的关系输入计算机，与哮喘和高血清总IgE进行连锁分析。

结果

　　一、血清总IgE水平

　　诏安地区哮喘家系样本血清总IgE水平为273±194 kIU/L（±s），其中成人为293±194 kIU/L，略高于儿童的水平（245±191 kIU/L）；哮喘患者的血清总IgE平均值无明显增高。以300 kIU/L定为诏安地区哮喘家系样本血清总IgE的正常值上限。

　　二、多态性遗传标记的分析结果

　　同位素掺入的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，读出每个个体的等位片段长度，按照从大到小顺序依次编号，即分别将D5S436和D5S393片段长度为250bp和186bp的带编号为1，片段长度每减少2bp则编号增加1，依次类推。北京和诏安地区39例正常无关个体的分析结果：D5S436共获得9种等位片段，变异分布在222～246bp的范围内，以8号片段（236bp）最为多见，9种等位片段共出现了22种基因型；D5S393共获得11种等位片段，变异分布在164～184bp的范围内，以6号片段（176bp）最为多见，11种等位片段共出现了29种基因型(表1)。分别计算北京和诏安地区正常无关个体的D5S436和D5S393两位点的基因型频率和等位片段频率，确认其均符合Hardy-Weinberg平衡，合并为一组，计算出D5S436和D5S393的PIC和HET两个参量。PIC分别为0.803和0.892，HET分别为0.823和0.898。诏安地区哮喘家系成员的等位片段变动范围与正常人群等位片段的变动范围一致，值得指出的是D5S436以8号片段最为多见，所占比例大于50%。

表1　中国人39个无关正常个体等位片段结果

　　三、连锁分析结果

　　都是哮喘患者的同胞对（共50对）, 用受累同胞配对法进行连锁分析，结果显示：D5S436与哮喘存在明显的连锁关系，P＜0.05；而D5S393与哮喘无明显的连锁关系，P＞0.05。用同样方法，将血清总IgE均值都大于300 kIU/L的同胞对（共17对）和他们的多态性位点的等位片段进行连锁分析，结果显示：D5S436和D5S393与高血清总IgE无明显的连锁关系。IBS和IBD两种连锁分析方法所得到的结果是一致的表2。

表2　两个位点与哮喘、高血清总IgE

　　两种连锁分析方法结果（t值）

　　注：受累同胞对，^* 为50对，^**为17对；^△ P＜0.05

讨论

　　多态性遗传标记就是DNA顺序中可检出的、群体频率不少于1%的遗传变异。这种变异多发生在DNA非蛋白编码区或者编码区非关键部分，在人群中呈孟德尔共显性遗传，包括限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphism,RFLP）、插入或缺失多态性（insertion/deletion polymorphism,INS/DELP）、 可变数目串联重复顺序（variable number tandem repeat,VNTR）和短片段串联重复顺序（short tandem repeat,STR）等。在进行遗传病的基因定位研究中，以STR的应用最为普遍。STR一般为1～8bp的重复序列，多在基因内含子或非编码区，人类中以（CA）的重复序列最多，约为5×10⁴～5×10⁵个，平均每6～15 kb的DNA就存在一个（CA）n，重复次数可达15～60次。本研究中所用的多态性遗传标记D5S436和D5S393，属STR类。我们通过对39个正常无关个体的实验分析，获得了中国人在该位点的资料。与欧洲白种人资料相比较，中国人群中D5S436出现了两种独特长度的等位片段，分别是10号（232bp）和15号（222bp）；D5S393的等位片段与国外文献报道基本相符^［7］。多态性遗传标记的多态性水平可以用PIC和HET表示，是判断遗传标记应用价值的重要参量。本研究所获得的中国人D5S436和D5S393的资料显示，两个位点PIC和HET的值均较高(＞50%)，表示可以提供较高的多态信息含量，属于高度多态的遗传标记，在基因定位连锁分析中均可以作为较为有效的多态性遗传标记。

　　选用受累同胞对通过IBS和IBD进行连锁分析，其原理就是当受累同胞对享有同一来源或是相同的标记等位基因的机率大于随机传递的期望值（50%），即提示该遗传标记与疾病性状相连锁。换言之，提示该标记与疾病基因位于同一染色体的同一区域内，所以在减数分裂过程中被共同分离至子代。此法判断效能弱于家系连锁分析，而且不能确定连锁程度，但优点是对系谱材料的要求低，只需一代或二代的家系成员，分析时不需准确拟定疾病表型的遗传模式，不受遗传参数的影响，对遗传异质性容许度较大，因此特别适合多基因遗传连锁分析^［9］。本研究对所掌握的哮喘家系样本中50对患哮喘的受累同胞对采用IBS和IBD法进行连锁分析，结果显示：哮喘与D5S436有连锁关系，P＜0.05；对17对血清IgE升高的受累同胞对进行分析显示：高血清IgE与D5S436和D5S393均未表现连锁关系。

　　染色体5q31～33区域上含有参与变态反应和哮喘炎症过程有关的大量调节因子基因群，包括白细胞介素簇（IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-12、IL-13）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（CM-CSF）、成纤维细胞生长因子酸（FGFA）、其他集落刺激因子和I型淋巴细胞特异的糖皮质激素受体（CSF-1R）以及β₂-肾上腺素能受体（ADRB2）基因等，因此一直是寻找调节血清总IgE水平及气道高反应性基因的热点区域之一。Mayers等^［4］用同胞配对分析法，对荷兰84个哮喘家系标本的研究，提供了D5S436与血清IgE及气道高反应性相连锁的依据；Marsh等^［5］则在美国Amish家系标本中采用了同样的分析，证实了白细胞介素基因簇、D5S393等遗传标记与血清总IgE的连锁关系。也有对此提出异议的研究报道。Blumenthal等^［10］和Sandford等^［11］用家系连锁分析及同胞配对法均未获得染色体5q31～33区域的遗传标记与血清总IgE及气道高反应性连锁的证据。迄今为止，尚未见到有关亚洲人种哮喘易感基因与染色体5q31～33区域连锁关系的研究报道。本研究在对中国人哮喘家系标本的遗传学分析中，获得了D5S436与哮喘相连锁的依据。这一初步结果，提示染色体5q31～33区域可能存在与中国人哮喘易感基因相关的一个或多个位点，为研究哮喘易感基因的重要候选区域之一。本研究未获得D5S436和D5S393与高血清IgE水平连锁关系的肯定结果，可能与样本量较少有关，同时综合国内外研究报道，亦不难看出，由于哮喘表型的多样性以及存在的较大的遗传异质性，并且易受环境因素的影响，从而加大了哮喘遗传研究的复杂性及难度。我们将进一步扩大样本数量，选择该区域其它STR标记以及位于该区域的参与调节哮喘免疫及病理过程的有关候选基因的多态性位点进行实验分析，综合运用多项统计学分析处理手段，对中国人哮喘易感基因与染色体5q31～33区域的连锁关系进行深入研究。

　　志谢　特别感谢福建省诏安县人民医院领导及医务人员在家系采集过程中的合作与支持；感谢中国医学科学院阜外医院流行病学研究室的顾东风主任和宫冒莲同学，军科院医学情报所统计学教研室胡良平主任在统计学分析上给予的帮助；并对我所李硕、伏瑾、李志英、王海俊、赵莉、丁秀原、宋方、王虹等表示感谢

　　本课题由北京市跨世纪人才工程专项基金资助

　　参考文献

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(收稿：1998-06-20　　修回：1998-09-01)