幽门螺杆菌相关性胃病的细胞增殖与凋亡的研究

癌症 2000年第6期第19卷 临床研究

作者：彭仲生　梁湛聪　谢礼雄　王养梅

单位：彭仲生　梁湛聪　谢礼雄　王养梅（广州医学院第一附属医院消化内科，广东广州510120）

关键词：幽门螺杆菌；胃粘膜；细胞凋亡；增殖细胞核抗原

　　【摘要】目的：观察幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染对其相关性胃病的细胞增殖与凋亡的影响，进而探讨胃癌的发生机理。方法：研究对象为正常人(normal subjects,NS)及慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)、慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)、慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生(chronic atrophic gastritis with intestinal metaplasia,CAGIM)、不典型增生(dysplasia,DYS)、胃癌(gastric cancer,GC)Hp阳性与阴性患者，共计11组，每组10例。细胞凋亡检测采用Tunel方法，细胞增殖检测采用免疫组化LSAB方法测定增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)。结果：CSGHp阳性患者细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)明显高于Hp阴性患者(P＜0.05)，其余4种胃病Hp阳性与阴性的患者AI比较均无显著性差异(P＞0.05)；CSG、CAG、DYS及GCHp阳性患者的细胞增殖指数(PCNA-LI)明显高于相应Hp阴性患者(P＜0.05)、CSG患者与NS人的AI/PCNA-LI比值无显著性差异(P＞0.05)，但两者均明显高于CAG、CAGIM、DYS及GC患者(P＜0.05)。结论：Hp感染可能通过诱导胃粘膜上皮细胞凋亡，从而刺激胃粘膜细胞不断增殖，结果引起凋亡/增殖比例失调，最终促进肿瘤发生

　　中图分类号：R573　文献标识码：A

　　文章编号：1000－467X(2000)06－0575－04

Study on the gastric epithelial cell proliferation and apoptosis in

　　Helicobacter pylori associated diseases of the stomach

PENG Zhong－sheng, LIANG Zhan－cong, XIE Li－xiong， et al.

　　Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical College,

　　Guangzhou 510120, P. R. China

　　【 Abstract】 Objective: To investigate whether Helicobacter pylori (Hp) would have any effects on the gastric epithelial cell proliferation and apoptosis,and a role in the pathogenesis of gastric cancer. Methods: Endoscopic gastric mucosal biopsies were taken from 1 group (10 cases) of normal subjects (NS) and 10 groups (10 cases for each group) of patients with chronic superficial gastritis (CSG), chronic atrophic gastritis (CAG), chronic atrophic gastritis with intestinal metaplasia (CAGIM) or dysplasia (DYS), and gastric cancer (GC) with or without Hp infection. Apoptosis cells in the gastric mucosa were quantitated after terminal deoxynucleatidyl transferase mediated dUTP nick and labelling (TUNEL method) and proliferation cells after immunohistochemical staining (LSAB method) of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Results: Apoptosis index (AI) of the patients with Hp positive CSG group was much higher than that of the patients with Hp negative CSG group (P＜ 0.05).There was no significant difference between the patients with or without Hp infection of the other four groups (P ＞0.05).PCNA Labelling indices (PCNA－LI) of the patients with Hp positive CSG, CAG, CAGIM, and GC groups were significantly higher than these of the patients with Hp negative groups， respectively (P＜ 0.05). There was no significant difference of AI/PCNA－LI ratio between the NS group and CSG group (P ＞0.05), but the AI/PCNA－LI ratio of these two groups was much higher than that of the CAG, CAGIM, DYS and GC groups (P＜ 0.05). Conclusion: Hp infection might induce apoptosis and thereby stimulate proliferation of the gastric epithelial cells, these effects might lead to the imbalance of the AI/PCNA ratio and ultimately promote the development of gastric cancer.

　　Key words: Helicobacter pylori; Gastric mycosa; Apoptosis; Proliferating cell nuclear antigen

　　幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染与慢性胃炎、消化性溃疡有较确切的关系，但与胃癌的关系尚未完全清楚。一般认为Hp在正常胃粘膜→慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生或不典型增生→胃癌发生过程中可能起一定作用。细胞凋亡是有核细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活，引起细胞自然死亡过程。细胞增殖与凋亡近年来受到重视，但Hp感染与细胞凋亡和增殖的关系以及Hp致病机理的报道较少。本研究通过对比慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)、慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)、慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生(chronic atrophic gastritis with intestinal metaplasia,CAGIM)、伴不典型增生(dysplasia,DYS)、胃癌(gastric cancer,GC)的Hp阳性与阴性病人以及无Hp感染的正常人(normalsubjects,NS)胃粘膜上皮细胞增殖与凋亡情况，目的在于观察Hp对上述疾病胃粘膜细胞增殖与凋亡的影响，进而对胃癌的发病进行探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1研究对象

　　共计11组，每组10例，各组性别、年龄无明显差别。CSG、CAG、CAGIM、DYS的炎症程度无明显差别。所有被研究的病例均无其它系统严重疾病或长期口服非甾体类药物和激素病史。NS组胃镜及光学显微镜下，均显示粘膜正常，Hp检查阴性。

　　1.2标本来源及Hp感染的诊断

　　每例病人于胃窦部或/和病灶部位取3～8块、胃体部取1块粘膜组织，其中胃窦部1块作尿素酶试验，其余作组织学检查。快速尿素酶试验阳性和改良Giemsa染色阳性者即诊断为Hp感染，Hp阴性的标准是上述两项检查均为阴性。

　　1.3　胃粘膜上皮细胞凋亡的原位检测

　　试剂盒(insitucelldeathdetectionkit,POD)为德国宝灵曼公司产品。操作步骤：(1)切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；(2)0.3％双氧水封闭30分钟阻断内源酶；(3)微波预处理；(4)15％牛血清浸泡30分钟；(5)加Tunel反应液，37℃，60分钟；(6)加过氧化物酶连接的荧光素抗体，37℃，30分钟；(7)DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。用DNA酶处理过的切片作阳性对照，以PBS替代Tunel反应液作阴性对照。

　　1.4胃粘膜上皮细胞增殖的检测

　　采用免疫组化LSAB方法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)，所有试剂购自DAKO公司，微波修复，PBS代替鼠抗作阴性对照。

　　1.5观察指标

　　病理组织学、细胞凋亡、细胞增殖的观察由三位不同医师完成。每张切片计算1000个以上完整上皮细胞或肿瘤细胞的凋亡细胞或PCNA阳性细胞数(分布于5个以上不同视野)，以100个细胞中阳性细胞数来表示细胞凋亡指数(AI，％)或增殖细胞指数(PCNA-LI，％)。

　　1.6　统计学处理

　　两样本均数比较采用t检验，两样本相关的比较采用直线相关分析。

　　2　结果

　　2.1细胞凋亡

　　Tunel染色细胞核中有棕黄色颗粒或核质呈现均匀的棕黄色者为凋亡细胞。NS组于胃粘膜表面见到凋亡细胞(见图1)；CSG组于整个胃小凹均见到凋亡细胞，Hp阳性者更为明显(见图2)；CAG组、CAGIM组及DYS组凋亡细胞多数分布于胃粘膜表面(见图3)；GC组于肿瘤细胞群中见少数散在性凋亡细胞(见图4)。各组AI见表1。

　　表1显示CSG组Hp阳性与阴性患者的AI比较有显著性差异(P＜0.05)，其余各组Hp阳性与Hp阴性患者之间比较均无统计学上差异(P＞0.05)。CAG、GC组患者无论Hp阳性与阴性，其AI均较NS组低，统计学上有显著性差异(P＜0.05)。

　　2.2细胞增殖

　　细胞核中出现棕褐色颗粒者为PCNA阳性细胞，主要分布于胃小凹底部和粘膜腺体中下部，CSG组Hp阳性患者及DYS组患者于整个胃小凹均可见到PCNA阳性细胞。各组PCNA-LI见表2。

表1各组细胞凋亡指数比较（％，±s）

Hp(＋)与Hp(－)比较，＊P＜0.05

表2各组细胞增殖指数比较(％,±s)

Hp(＋)与Hp(－)比较，＊P＜0.05

表3各组AI/PCNA-LI比较(％,±s)

Hp(＋)与Hp(－)比较，＊P＜0.05

　　CSG，CAG，DYS及GC组Hp阳性与阴性患者比较有显著性差异(P＜0.05)，CAGIMHp阳性患者PCNA-LI虽然高于Hp阴性患者，但无统计学上差异(P＞0.05)，5种胃病无论Hp阳性与Hp阴性患者PCNA-LI均显著高于NS组。

　　2.3细胞凋亡与细胞增殖关系

　　对细胞凋亡与细胞增殖进行相关分析，发现NS组，CSG组Hp阳性、阴性患者及CAGIMHp阳性患者，细胞凋亡与细胞增殖呈正相关，统计学上有意义(P＜0.05)，GC组患者呈现负相关趋势，但统计学上无意义(P＞0.05)，其余各组无明显相关。各组AI/PCNA-LI比值见表3。

　　比较5种胃病Hp阳性与Hp阴性的AI/PCNA-LI只发现DYS组有显著性差异(P＜0.05)，其余各组虽然Hp阴性患者高于Hp阳性患者，但无统计学上差异(P＞0.05)。

　　3　讨论

　　正常胃粘膜上皮细胞存在增殖与凋亡，藉以维持细胞生理动态平衡[1]。本研究显示的正常胃粘膜增殖细胞及凋亡细胞分布特点证实了这一平衡。

　　本研究发现Hp阳性的CSG患者细胞凋亡较Hp阴性患者明显增高，提示Hp感染能增加CSG患者的胃粘膜上皮细胞凋亡，这一结果与文献报道^[2,3]一致。Hp诱导胃粘膜上皮细胞凋亡的原因尚不清楚，大多数研究显示为Hp的直接作用，可能与氨、细菌毒素VacA和CagA等有关^[2,4]，我们也认为是Hp的直接作用。此外，本研究发现CSGHp阴性患者细胞凋亡指数虽低于Hp阳性患者，但明显高于正常人，说明其细胞凋亡增加除Hp作用外，可能还有其它因素的参与。CAG伴有肠化时与非肠化CAG的细胞凋亡指数相差很大，其原因不清，可能与肠上皮化生、细胞凋亡增加而出现新的凋亡增殖平衡有关。GC患者细胞凋亡受抑制，有利于肿瘤生长。

图1Tunel染色，示正常人凋亡细胞位于胃粘膜表面，SP×200

图2Tunel染色，示慢性浅表性胃炎Hp阳性患者整个胃小凹见到凋亡细胞，SP×200

图3Tunel染色，示慢性萎缩性胃炎Hp阳性患者凋亡细胞位于胃粘膜表面，SP×200

图4Tunel染色，示胃癌Hp阳性患者凋亡细胞分布于肿瘤细胞之中，SP×200

　　有关Hp对细胞增殖的作用报道不一，大多数体外试验显示Hp能抑制细胞增殖^[5]，但多数体内胃粘膜细胞研究显示Hp能促进细胞增殖^[3,6]。本研究发现CSG、CAG、DYS及GCHp阳性患者胃粘膜细胞增殖指数较相应Hp阴性患者明显增高，提示在胃癌发生过程中Hp对多数病变的细胞增殖有促进作用。Hp感染促进胃粘膜上皮细胞过度增殖可能与细胞凋亡增加、细胞毒素CagA等有关^[6,7]。

　　本研究发现NS组细胞凋亡与细胞增殖的比值为0.893，且成正相关关系，CSG患者细胞凋亡与增殖均增加，但其比值与NS相比，无明显差异，随着病变进一步发展，凋亡指数/增殖指数的比值明显降低，增殖细胞数目不断增长，最终发展成为肿瘤。

　　总之，Hp感染初期可能通过诱导胃粘膜上皮细胞凋亡，从而刺激胃粘膜细胞过度增殖，随后胃粘膜上皮细胞不断增殖，而细胞凋亡没有相应增加，造成凋亡/增殖比例失调，最终发展成为肿瘤。

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收稿日期：1999－08－03；修回日期：1999－11－10