低分子肝素在麻醉大鼠胃肠道的吸收

中国现代应用药学 1998年第3期第15卷 药剂

作者：王作鹏　秦海敏

单位：王作鹏　秦海敏(杭州 310018 杭州九源基因工程有限公司)

关键词：低分子肝素；口服给药；抗Xa活性；抗血栓

　　摘要　目的：以血浆抗Xa活性及体内抗静脉血栓形成为指标，考察了低分子肝素(LMWH)溶液及乳剂在麻醉大鼠胃肠道的吸收情况。方法：LMWH溶液和乳剂给大鼠灌服或十二指肠直接注入给药，颈动脉插管取血、生色底物法测血浆抗Xa活性，并考察对实验性颈静脉血栓形成的预防作用。结果：在5000 Anti-Xa IU/kg的剂量下,LMWH溶液灌胃给药时血浆抗Xa活性与空白对照没有显著差别，而与油酸、胆盐制成乳剂后灌服则血浆抗Xa活性明显升高，可达0.508±0.18 Anti-Xa IU/ml的峰值，并有显著抗静脉血栓作用；同样剂量十二指肠给药，两种剂型都有显著吸收，在给药后1h左右达到血药峰值，分别为1.12±0.916 Anti-Xa IU/ml(溶液),1.25±0.526 Anti-Xa IU/ml(乳剂)，与100 Anti-Xa IU/kg剂量下LMWH注射液静脉给药后0.5h的血药水平相当，并显示明显的抗静脉血栓形成活性。结论：LMWH在胃液中可能被破坏，在十二指肠能够有所吸收，与油酸、胆盐制成乳剂可保护并促进LMWH的吸收。

Gastrointestinal absorption of low molecular

　　weight heparin in anesthetized rats

Wang Zuopeng(Wang ZP),Qin Haimin(Qin HM)

　　(Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co.Ltd,Hangzhou 310018))

　　ABSTRACT　OBJECTIVE：To investigate the gastrointestinal absorption of LMWH solution and emulsion in anesthetized rats.METHODE:LMWHs formulated as solution to emulsion were given by gastric garage or duodenal injection in anesthetized rats.Blood samples were collected and analyzed for anti-Xa,while anti-thrombosis activities were vestigated.RESULTS:At a dosage of 5000 Anti-Xa IU/kg,there was no significant change in plasma anti-Xa activity between gastric garage administration of LMWH solution and blank control;however,plasma anti-Xa activity was significantly increased after gastric garage administration of LMWH emulsion and significant anti-thrombosis activity was observed.In contrast,at the same dosage by duodenal injection,significant absorption was observed in both formulations,reaching peaks around 1 hour after administration.Significant anti-thrombosis activity was also observed.CONCLUSION:LMWH may be destroyed by gastric juice.But can be absorbed in duodenum at certain level.Formulation with monoolein or taurocholate can promote its absorption.

　　KEY WORDS　LMWH,oral administration,Anti-Xa activity,anti-thrombosis activity

　　肝素是传统的抗凝药，临床应用一直局限于注射给药，因为它是一种含多阴电荷的大分子化合物，不易通过胃肠粘膜，并且易在胃液中灭活，故口服无效。人们曾使用多种方法改善、促进其胃肠吸收，但至今尚没有理想的口服制剂问世。

　　低分子肝素(LMWH)是从普通肝素分离或降解得到的小分子的组分或片段。仍具有抗凝、抗血栓活性，与普通肝素相比，LMWH的化学本质虽然未变，但分子量及所带电荷均下降，理论上有利于透过消化道粘膜。据报道^［1］LMWH的口服吸收性能较肝素有所改善；十二指肠给药效果更加明显^［2］；但也有研究显示口服没有吸收^［3］。因不同来源、不同分子量的LMWH性质不尽相同，可能造成研究结果的差异，本实验即考察以肝素为原料应用亚硝酸裂解法制备的LMWH在大鼠胃肠道的吸收，探索发展LMWH口服制剂的可行性。

　　1　动物与材料

　　Wistar大鼠(购于浙江医科大学)，低分子肝素钠(杭州九源基因工程有限公司)，应用亚硝酸裂解法制备(平均分子量：3300)。油酸(杭州双林化工试剂厂)，牛胆盐(包头市生物化学制药厂)，抗Xa试剂盒(Shanghai Beite Biotechnology Co.LTD)，低分子肝素标准品(Counecil of Europe,103.6 Anti-Xa Iu/vial)。自动记录型紫外可见分光光度计(UV-2101PC型，日本岛津)。

　　2　实验方法

　　2.1　制剂制备

　　LMWH溶液：取LMWH用蒸馏水配成1000IU/ml溶液；LMWH乳剂：配方：1000IU/ml LMWH,0.04M油酸,0.04M胆盐。制备：先将水溶性物质溶解，再把油酸慢慢滴加至水相中，超声处理5min,得到类白色均匀乳剂，临用前振摇。LMWH注射剂：取LMWH用生理盐水配制成100IU/ml注射液。

　　2.2　给药

　　取Wistar ♂大鼠30只，体重200～280g,随机分成六组，每组5只，实验前动物禁食一昼夜，其中三组分别灌服LMWH溶液，LMWH乳剂及空白介质，按5ml/kg给药，灌服后用戊巴比妥50mg/kg腹腔注射麻醉；另外三组分别作为静脉给药组和LMWH溶液及乳剂十二指肠给药组，均先用戊巴比妥50mg/kg腹腔注射麻醉。静脉给药：自大鼠股静脉注射给药,100IU/kg;十二指肠给药：待麻醉后，自腹中线剖开大鼠腹腔，结扎小肠远端，将药液直接注入十二指肠，剂量为5ml/kg。

　　2.3　血浆抗Xa活性

　　手术分离出一侧颈动脉，作颈动脉插管(聚乙烯导管)，分别于给药后30,60,120min动脉取血，血液加入3.8%枸橼酸钠(按9∶1比例)。3000r/min离心10min，取血浆-20℃保藏。融化后测定抗Xa活性。

　　血浆抗Xa活性测定应用生色底物法^［4］,用新鲜人血浆配制系列浓度的标准液，各取50μl,分别加入FXa 200μl,混匀。同样制备样品液。随后将混匀的溶液于37℃保温1min,精确加入生色底物S-222(200μl),于37℃水浴中准确保温1min，保温结束立即加入2%的柠檬酸(200μl),混匀。于波长405nm测定吸收度(A)。根据所测得的标准曲线计算其样品的抗Xa活性。

　　2.4　抗静脉血栓形成作用

　　手术分离出另一侧颈静脉，给药后滴加几滴福尔马林-甲醇溶液于颈静脉上，4h后剪开静脉，检查血栓形成情况^［5］。

　　2.5　数据处理

　　数据按数理统计方法处理，计算均值、标准差及进行t检验。

　　3　结　果

　　3.1　血浆抗Xa活性

　　各组样品血浆抗Xa活性测定随机交叉进行，结果显示(表1):LMWH溶液灌胃给药组与空白对照组血浆抗Xa活性没有显著性差异(P＞0.05)。而LMWH乳剂灌胃组在给药后1,2h,血浆抗Xa活性显著高于空白对照组(P＜0.01)。

表1　LMHW制剂不同方式给药后0.5，1，2h大鼠血浆抗Xa活性(±s,n=5)

　　注：ig：灌胃给药；id：十二指肠给药；iv：静脉给药；各给药组与同一时间的空白对照组比较，^*1P＜0.05；^*2P＜0.01；LMWH乳剂灌胃给药组与溶液灌胃给药比较，^*3P＜0.05；^*4P＜0.01　　LMWH溶液和乳剂在十二指肠给药时都显示明显的吸收。LMWH溶液组在给药后1,2h的血浆抗Xa活性显著高于空白对照组(P＜0.05);LMWH乳剂组则在各时间点与相应空白对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)。

　　在灌胃给药方式中，LMWH乳剂组血浆抗Xa水平高于溶液组，两者在给药后1,2h的相应血浆抗Xa水平有显著性差异(P＜0.05、0.01)。

　　LMWH注射液静脉给药后，在0.5,1,2h血浆平均抗Xa活性依次降低。按一级动力学模型估算其血浆半衰期(t_1/2)为1.12h。

　　3.2　抗静脉血栓形成作用

　　所用血栓模型为大鼠静脉血栓模型，结果以滴过福尔马林-甲醇溶液的静脉段出现栓塞为阳性，血流正常未出现栓塞为阴性。

　　LMWH各个剂型及不同给药方式的抗栓效果见表2。可见LMWH溶液灌胃给药组有一半的动物出现阴性，其它各给药组则全部为阴性，而空白对照组大鼠则全部呈现阳性。

　　4　讨　论

　　低分子肝素具有抗凝、抗血栓等多种生物活性，与普通肝素比较具有抗栓作用强，出血副作用小，皮下给药生物利用度高，半衰期长等特点，是肝素的换代产品。临床上一般用于手术、中风等引起的静脉血栓的预防和治疗。对于血栓易发患者的预防给药，开发LMWH口服制剂具有特殊的意义。

表2　LMWH对大鼠实验性静脉血栓的预防作用

　　注：ig：灌胃给药；id：十二指肠给药；iv：静脉给药；因手术后观察时间较长，部分动物死亡　　LMWH是由一类分子量不均一的小的肝素片段组成，属于带大量负电荷的粘多糖类，理论上仍然不适合于透过胃肠粘膜。对LMWH能否口服吸收，仍存在相矛盾的意见。本实验证明由肝素经亚硝酸裂解生产的LMWH(MW3300)溶液口服没有明显吸收(以血浆抗Xa活性表示)，但十二指肠内直接注入LMWH溶液则在血浆中可检测到较高水平的抗Xa活性，显示了明显的吸收效果。提示口服LMWH可能在胃内被破坏失活，因为LMWH在酸性环境下不稳定，并且胃液中还有肝素酶存在，可降解LMWH。LMWH在十二指肠的吸收机理尚不清楚，可能依赖于胆汁的作用^［6］。

　　另外，结果也显示以5000 Anti-Xa IU/kg剂量十二指肠内注入LMWH溶液，可在1h左右达到吸收峰值(平均:1.12IU/ml)。其血浆峰浓度与100 Anti-Xa IU/kg剂量下静脉注射给药0.5h的血浆浓度相当。提示LMWH溶液虽在十二指肠内有所吸收，但吸收量较低。

　　肝素与油酸、胆盐制成胶团(micellar)或乳剂形式，可提高肝素在大鼠消化道的吸收^［7～9］。本实验证实LMWH与油酸、胆盐制成乳剂形式使口服给药也能吸收。说明由油酸、胆盐形成的胶团对LMWH通过酸性胃液有保护作用。十二指肠给药吸收更加显著，血浆抗Xa水平高于LMWH溶液，但是两组间的差异没有显著性(P＞0.05)。油酸、胆盐是否对LMWH在十二脂肠的吸收有促进作用还需进一步实验证实。另外，LMWH乳剂灌胃给药吸收程度远低于十二指肠给药，表明仍有相当一部分LMWH在胃中被破坏，有待进一步改善制剂，以提高其保护效果。油酸和胆盐都安全无毒，对胃肠粘膜没有损伤^［10］。

　　血浆抗Xa活性被认为是反映LMWH抗栓药效的重要指标之一，血浆抗Xa活性测定结果与预防实验性血栓形成活性结果基本一致。但血浆抗Xa活性并不能完全说明其抗栓作用，现代研究表明血栓的形成是由血管内皮、凝血因子及血细胞等多因素综合作用的结果。LMWH是一个混合物，其中的小分子片段可更易于透过消化道粘膜而优先被吸收。这部分LMWH没有或有很弱的抗Xa活性，但仍有抗栓作用^［11］。这可能解释LMWH溶液灌胃给药没有抗Xa活性但却表现一定预防血栓形成活性。

　　参考文献

　　1　Doutremep C,Toulemonds F,Lormeau JC.Oral administration of low molecular weight heparin fractions in rabbits.Semin Thromb Hemost,1985,11(3)∶323.

　　2　Doutremepiuch C,Toulemonde F,Maury MO,et al.Intestinal absorption of low molecular weight heparin fractions in rabbits.Circulation,1982,66∶Ⅱ-303.

　　3　Dryjski M,Schneider DE,Mojaverian P,et al.Investigations on plasma activity of low molecular weight heparin after intravenous and oral administrations.Br J Clin Pharmac,1989,28(2)∶188.

　　4　Arne N,Mette L,Ulrich Abildgaaard.Assay of heparin in plasma using.A chromogenic substract for activated factor X.Thrombosis Res,1976,8∶413.

　　5　Jaques LB,Hiebert LM,Wice SM.Evidence form endothelium of gastric absorption of heparin and of dextran sulfates 8000.J Lab Clin Med,1991,117(2)∶122.

　　6　Guarini S.Absorption of heparin injected into various parts of the rat intestinal tract:a bile-dependent mechanism?Pharmacology,1985,31∶150.

　　7　Engel RH,Farhenbach MJ.Intestinal absorption of heparin in rat and gerbil.Proc Soc Exp Biol Med,1968,129∶772.

　　8　Tanigushi K,Muranishi S,Sezaki H.Enhanced intestinal permeability to macromolecules.Inter J Pharmac,1980,101(4)∶219.

　　9　Muranishi S,Todunaga Y,Taniguchi K,et al.Potential absorption of heparin from the small and the large intestine in the presence of monoolein mixed micelles.Chem Pharm Bull,1977,25(5)∶1159.

　　10　Teem MV,Phillips SF.Perfusion of the hamster jejunum with conjugated and unconjugated bile acids:inhibition of water absorption and effect on morphology.Gastroenterology,1972,62∶261.

　　11　Kakkar VV.Prevebtion of postoperative venous thromboembollsm by a new low molecular weight heparin fraction.Nouv Rev Fr Hematol,1984,26∶277.

收稿日期：1997-07-21