有望用于治疗SARS的新技术：RNA干扰

　　摘自《中国医学论坛报》：RNA干扰（RNA interference）是一种由双链RNA诱发的基因沉默（gene silencing）。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制了该基因的表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。国内已有研究机构将该技术用于SARS治疗的攻关研究。本文简要介绍RNA干扰的研究历史、作用机制和应用。

　　人们对RNA干扰的认识来源于用蠕虫（Caenorhabdiris elegans）和果蝇（drosophila）所进行的实验。最初的实验结果显示，有义链RNA（sense-stranded RNA）或反义链RNA（antisense-stranded RNA）都可抑制蠕虫基因的表达。进一步的实验表明，双链RNA比单链RNA更有效。将特异的双链RNA注入蠕虫体内可抑制有同源序列的基因的表达达数天之久。这种抑制作用不仅见于接受双链RNA注射的蠕虫，而且也见于子代蠕虫。据推算，数个双链RNA分子即可抑制基因的表达。

　　RNA干扰的详细机制尚不清楚。现有实验资料提示，RNA干扰过程主要有2个步骤（如图所示）：（1）长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA）。（2）小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。一种称为Dicer的核酸酶被证明参与将双链RNA切成小干扰性RNA的过程。该酶存在于多种生物体内，在人细胞中也有类似的酶。该酶是否直接参与切断靶mRNA还不清楚。阐明小干扰性RNA在双链RNA诱发的基因沉默中的作用是RNA干扰研究中最重要的发现之一。

　　小干扰性RNA的发现不仅加深了人们对RNA干扰机制的认识，同时突破了一个用长双链RNA在哺乳类细胞中抑制基因表达时常常遇到的障碍，即非特异性作用。长于30个碱基对的双链RNA常常会激活蛋白激酶而诱发对蛋白质合成的非特异抑制。小干扰性RNA一般不会在哺乳类细胞中诱发这种非特异性抑制。用人工合成的小干扰性RNA可特异性地抑制哺乳类细胞中外源性或内源性基因的表达。实验表明，长度为21个碱基、3’末端有2个碱基突出的小干扰性RNA活性较高。小干扰性RNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。在小干扰性RNA上一个错配的碱基对即可使其失去原有的抑制基因表达的活性。换言之，只有与小干扰性RNA高度同源的mRNA才会被降解。这一特性在将RNA干扰技术用于治疗人类疾病时极为重要，为减少或避免抑制不相关基因奠定了基础。

　　在设计小干扰性RNA的靶位点时，应尽量选择对靶mRNA特异、而与其他内源性基因无同源性的核苷酸序列。并非靶mRNA上的所有序列都是小干扰性RNA的有效靶位点。目前尚没有选择小干扰性RNA靶位点的可靠实验方法或计算机程序。可决定小干扰性RNA靶位点是否有效或效力如何的因素仍是个谜。尽管小干扰性RNA和反义DNA（antisense DNA）都能持异性地降解mRNA，但它们的作用机制不同，且它们在同一mRNA上的有效靶位点似乎也不相关。

　　除使用人工合成的小干扰性RNA之外，人们已经成功地使用发夹状RNA或以质粒DNA或病毒为载体在细胞内生成小干扰性RNA样转录物，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳类动物或人细胞内表达。用质粒DNA或病毒为载体可在细胞内长时间、稳定地生成小干扰性RNA。此类研究将有助于把RNA干扰技术用于治疗人类疾病。在大多数用哺乳类细胞做的RNA干扰实验中，双链RNA比单链RNA更有效。尽管有假说认为，也有少数实验结果显示，双链RNA通过其反义链而起作用，但仅使用反义链RNA常常不能在哺乳类细胞中有效抑制基因的表达。

　　目前RNA干扰技术主要应用于探查基因功能和探索治疗肿瘤或感染性疾病的可能性。用RNA干扰技术可抑制蠕虫16757个基因中的约885个基因的功能，其中许多基因有人同源基因。查明蠕虫基因的功能将为研究人基因功能提供有用的信息。如一项用RNA干扰技术筛查蠕虫的脂肪调节基因的研究表明，50%以上的蠕虫脂肪调节基因在哺乳类中有同源基因，而这些同源基因以前从未被认为与调节脂肪存储有关。研究这些基因将有助于发现与人类肥胖相关的基因，进而治疗肥胖或相关疾病。另一个例子是，用RNA干扰技术在蠕虫中找到了61个与基因组稳定相关的基因。这些基因可能与DNA修复、复制、染色质形成和细胞周期调控有关，其中82%有人同源基因。这些研究结果或许有助于发现潜在的人肿瘤抑制物。

　　初步的实验结果提示RNA干扰技术可用于治疗有异常基因的人肿瘤。K-RAS蛋白为肿瘤发生所必需。bcr/ab1融合基因与人白血病有关。用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。

　　RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。那么，设想通过RNA干扰治疗病毒感染性疾病就是“顺理成章”的事。初步的实验结果表明这种设想有可能变成现实。用小干扰性RNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）的某些基因，如P24、Vif、nef、tat或rev可阻碍HIV在细胞内复制。用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可阻碍HIV感染细胞。也有通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制的报道，如脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。目前在我国部分地区和其他国家发生的SARS的病原被初步确定为新的冠状病毒。该毒株的核苷酸序列测定在国内外均已完成，理论上RNA干扰技术可用于抑制该病毒在细胞内的复制。

　　本文所述资料均为非人体试验的结果。将RNA干扰技术用于临床治疗人类疾病还有许多研究工作要做，如何将小干扰性RNA或能在细胞内生成小干扰性RNA样转录物的质粒DNA或病毒载体安全、有效地导入靶组织或靶细胞就是一个必须解决的问题。RNA干扰技术用于治疗人类疾病的安全性仍是个未知数。

　　总之，RNA干扰是存在于许多生物（包括植物和人）体内的一种自身防御机制，同时也可能是一种内源性基因表达的调控机制。通过RNA干扰抑制基因表达具有高特异性和高效率。尽管RNA干扰的详细机制尚不清楚，大量的体外实验研究资料已经显现出该技术在基因功能研究中的应用前景和新药开发中的巨大潜力。近2～3年以来，RNA干扰技术已引起生物学和医学科学工作者愈来愈多的关注。 (《中国生物信息》)

2003.06.13