慢性肝病及原发性肝癌患者血清中自身抗体分析

　　第二军医大学学报2000年第21卷第4期

范列英　仲人前　李红梅　夏晴

　　摘　要　目的：探讨慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌患者血清中自身抗体的变化规律。方法：收集342例慢性肝病和肝癌血清标本，以Hep-2细胞和猴肝组织为抗原基质，采用间接免疫荧光法检测自身抗体。结果：慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者抗核抗体(ANA)的阳性检出率分别为21.8%（35/160），27.5%（30/109）和34.2%(25/73)，均明显高于对照组的3%（6/200）。3组ANA核型种类较多，但均以颗粒型为主。以蛋白质印迹法检测抗可提取性核抗原(ENA)抗体。发现40例ANA颗粒型的患者，有12例nRNP/Sm和（或）SSA阳性，3例Scl-70和2例Jo-1阳性；15例ANA均质型有7例为抗双链DNA抗体和1例抗组蛋白抗体。对照组中2例ANA颗粒型分别为nRNP/Sm和SSA阳性。3组病例的胞质抗体有多种，以抗线粒体抗体阳性率最高，肝硬化和肝癌组分别达12.8%和12.3%；慢性肝炎组为8.9%。结论：慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中不仅存在着自身抗体，而且显著高于正常人。ANA的靶抗原中除一部分是目前已鉴定的外，大部分有待于进一步鉴定。

　　关键词：抗体，抗核；核抗原；慢性肝炎；肝肿瘤

　　我国是乙型肝炎高发区，急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点^［1］。有文献报道，日本人的慢性肝炎、肝癌患者血清中能检测到抗核抗体(ANA)，但其临床和生物学意义不明^［2］。有关在中国人的慢性肝炎、肝癌患者中，有多少伴有自身免疫现象以及自身靶抗原是什么等方面的研究均未见报道。我们收集了342例慢性肝病和原发性肝癌患者血清，以间接免疫荧光法（IIF）、蛋白质印迹法检测自身抗体,为探讨自身抗体在病毒性肝炎、肝癌发病中的作用奠定基础。

　　1　资料和方法

　　1.1　研究对象　选择本院住院患者，经血清学和病理检查确诊者。其中慢性肝炎160例，男性93例，年龄29～58岁，女性67例，年龄27～67岁；肝硬化109例，男性62例，年龄40～75岁，女性47例，年龄45～80岁；肝癌73例，男性54例，年龄32～78岁，女性19例，年龄33～72岁。3组病例肝炎病毒感染情况见表1。随机收集200例献血员（年龄18～55岁）血清作为正常对照组同时测定。

表 1　慢性肝病和肝癌患者发病原因

　　tab 1　Origin of chronic hepatitis,cirrhosis,

　　and hepatocellular carcinoma

　　a :non-A,non-B,non-C related chronic hepatitis and recessiveness1.2　检测方法

　　1.2.1　IIF法检测自身抗体　抽取患者空腹外周血，分离血清。IIF检测试剂盒由德国Euroimmuno公司惠赠。取25μl血清（1∶100稀释）滴加在抗原基质（Hep-2细胞和猴肝组织切片）上，室温孵育30 min,PBS （pH 7.2） - 0.2% Toween 20洗片，滴加ITFC标记的抗人免疫球蛋白抗体，室温30 min，洗片，以甘油封片，荧光显微镜（德国Leica公司）镜下观察。

　　1.2.2　蛋白质印迹法检测抗ENA抗体　选择经上述IIF检测获得的ANA阳性血清，用德国Euroimmuno公司的ENA试剂盒检测。简要操作如下：取已印有snRNP/Sm，Sm，SSA，SSB，双链DNA（dsDNA），组蛋白，核糖体P蛋白（Ribosomal p protein），Scl-70，Jo-1纯抗原的硝酸纤维素膜，用1∶100稀释的血清处理，室温、旋转摇动300 r/min 共30 min，洗涤剂洗膜15 min，用AP-抗人IgG与膜，室温反应30 min，洗膜，加入底物反应10 min后观察结果。

　　2　结　果

　　2.1　IIF法检测自身抗体　(1)慢性肝炎、肝硬化、肝癌ANA的阳性率分别为21.8%，27.5%，34.2%，均显著高于正常对照组(P＜0.01，表2)，但3组病例之间无显著差异。ANA的核型有多种，均以颗粒型为主。此外，30％左右的ANA单独或含有抗核仁型自身抗体。分别以Hep-2细胞和猴肝组织切片为抗原基质同时检测，结果发现大多数阳性血清能在Hep-2细胞和猴组织切片中检测到，但也有少数血清仅在猴肝组织中为阳性，这种情况在肝癌患者血清中多见（表2）。提示在慢性肝炎、肝硬化，尤其是肝癌患者体内存在肝细胞特异性靶抗原。(2)3组病例的抗胞质抗体有多种，其中以抗线粒体抗体阳性率最高，肝硬化和肝癌组分别达12.8%和12.3%，慢性肝炎组为8.9%。此外，有6例在肝细胞胞质内有斑点状荧光着染（表3）。

表 2　慢性肝病和肝癌患者血清中ANA的检出情况

　　tab 2　The detective results of ANA in the patients with chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma

　　H:Homogeneous; G:Granular; N:Nucleolar; MSA:Mitotic spindle apparatus; Centro:Centromere;^**P ＜0.01 vs control group

表 3　慢性肝病和肝癌患者细胞质内的自身抗体

　　tab 3　The anti-cytoplasmic autoantibodies in the patients with chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma

　　AMA:Antimitochondrial antibodies; Cytosk:Anticytoskeletal antibodies; Golgi:Antigolgi apparatus antibodies； Ribo:Antiribosoma antibodies; Lyso:Antilysosomal antibodies; Sp:Speckle2.2　蛋白质印迹结果　(1) 40例IIF法测得的颗粒型或斑点型ANA阳性血清中，有12例nRNP/Sm和(或)SSA阳性，3例Scl-70和2例Jo-1阳性；14例均质型ANA,7例dsDNA和1例组蛋白阳性。(2)6例ANA阳性献血员中，2例颗粒型分别为nRNP/Sm，SSA，2例均质型为组蛋白阳性。

　　3　讨　论

　　近几年陆续有人报道，在慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝癌患者体内存在着自身抗体^［2～5］。我们用IIF法检测了342例慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者，发现在中国人的慢性肝病和肝癌患者体内不仅存在自身抗体，而且其阳性率高于Imai等^［2］的报道。在我们检测的患者中有88％以上有HBV慢性感染病史，提示HBV感染可引发机体自身免疫紊乱，产生自身抗体。而自身抗体对慢性病毒性肝病患者的肝细胞损伤是否起作用，则有待于深入研究。

　　IIF法检测ANA，一般以Hep-2细胞作为抗原载体。Hep-2细胞是人喉癌细胞株，具有人细胞抗原、易培养、核大易观察等优点，但会遗漏针对肝细胞特异靶抗原的自身抗体。研究结果显示，ANA阳性的35例慢性肝炎和30例肝硬化患者中分别有4例和2例仅含针对肝特异性靶抗原的自身抗体，而25例ANA阳性的肝癌患者中有7例含针对肝特异性靶抗原的自身抗体，表明以Hep-2细胞和猴肝组织切片共同作为抗原基质，能明显提高自身抗体的检出率，同时也提示在慢性肝脏炎症、肝癌患者体内存在针对肝细胞特异性的自身免疫反应。但具体发生哪些变化、其在肝细胞癌变中起什么作用，尚不明确。

　　Imai等^［2］在由慢性乙肝发展成肝癌的患者血清中鉴定出3种与细胞增殖、分裂相关的核仁成分蛋白：NOR-90，Fibrillarin，B23蛋白^［7］。在我们检测的3组病例中，核仁型抗体占阳性ANA的30％左右，其相应的靶抗原正在被分离、鉴定。为了进一步鉴定慢性肝病和肝癌患者中ANA的靶抗原，我们采用纯抗原蛋白质印迹的方法，测定目前已经明确的、与某些自身免疫性疾病相关的自身抗原，包括nRNP，Sm，SS-A，SS-B，dsDNA，Histone，核糖体P-蛋白、Scl-70和Jo-1，结果40例斑点型/颗粒型ANA仅有12例nRNP/Sm和（或）SS-A阳性，3例Scl-70阳性，2例Jo-1阳性；14例均质型ANA有7例ds-DNA阳性，1例Histone阳性。表明慢性病毒性肝病和肝癌患者的自身靶抗原，除了是一些目前已鉴定的、与常见自身免疫性疾病相关的自身抗原以外，还有许多有待于进一步鉴定。

　　在病毒性肝病和肝癌血清中，抗细胞质内成分的自身抗体种类也有多种，但其阳性率明显低于自身免疫性肝炎^［8］。目前对慢性肝病中的抗线粒体抗体、抗细胞骨架蛋白抗体等升高的原因及其作用仍不清楚。在我们实验中发现的斑点状抗胞质成分抗体的自身靶抗原也有待于进一步鉴定。

　　目前自身免疫在病毒性肝炎、肝癌发病机制中的作用已逐渐受到人们的重视。已经被鉴定的靶抗原多数是与细胞内DNA合成、细胞分裂和增殖相关的蛋白^［3,9］。但是自身免疫在病毒感染性肝病中是怎样被启动的以及自身抗体在病毒性肝炎的发展和转归中的作用均有待于深入研究。

　　参考文献

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