PAI-1在TGF-β₁基因和反义TGF-β₁基因转染人肝癌细胞株中的表达

临床与实验病理学杂志 2000年第3期第16卷 实验病理学

作者：林文生　张农　张颂文　顾建新　郭慕依

单位：林文生 张农 郭慕依（上海医科大学　病理学教研室）；张颂文 顾建新（基因研究中心　200032）

关键词：肝肿瘤；肝癌细胞株；转化生长因子-β；纤溶酶原激活物抑制剂；转染

　　摘要　目的：通过对人肝癌细胞株(SMMC-7721)转染TGF-β₁基因及反义TGF-β₁基因，观察该细胞PAI-1表达的变化。方法：采用电穿孔法进行基因转染，并用Western blot、Northern blot法加以鉴定后，分别应用Western blot及Northern blot观察该细胞表达PAI-1 mRNA的变化。结果：过表达的TGF-β₁细胞克隆PAI-1 mRNA表达均高于对照组，而低表达TGF-β₁者PAI-1 mRNA表达低于对照组。结论：TGF-β₁可能通过上调肝癌细胞PAI-1的表达，在肝癌浸润和转移过程中发挥重要作用。

　　中图分类号　R735.7　　文献标识码　A

　　文章编号　1001-7399(2000)03-0221-03

Expression of PAI-1 on human hepatoma cells transfected by TGF-β₁ gene and antisense-TGF-β₁ vector

Lin Wensheng　Zhang Nong　Zhang Songwen　Gu Jianxin　 Guo Muoyi

　　（Shanghai Medical University, Shanghai　200032）

　　ABSTRACT　Purpose　To study the expression of PAI-1 on human hepatoma cells (SMMC7721) transfected by TGF-β₁ gene and antisense-TGF-β₁ vector. Methods　Electroporation for gene transfection, which was confirmed by Western blot and Northern blot; Northern blot and Western blot analysis were used for detecting the expression of PAI-1 on transfectants. Results　Higher and lower mRNA levels of PAI-1 were observed in SMMC 7721 cells transfected with TGF-β₁ gene and antisense-TGF-β₁ vector, respectively. Conclusion　It is possible that TGF-β₁ is involved in the invasion and metastasis of human hepatoma by upregulating PAI-1 expression.

　　KEY WORDS　liver neoplasms;hepatoma cell line; transforming growth factor beta; plasminogen activator inhibitor;transfection

　　纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)在肝细胞性肝癌中过表达与肝癌的侵袭行为密切相关^〔1～3〕。同时，大量研究结果表明，转化生长因子-β1(TGF-β₁)具有多种生物学活性，与肿瘤生物学行为密切相关，在肝细胞性肝癌中表达增强^〔4〕。为了研究肝细胞性肝癌中过表达TGF-β₁和PAI-1间是否有内在联系，本实验将TGF-β₁基因和反义TGF-β₁转染SMMC 7721人肝癌细胞株，观察TGF-β₁对该细胞表达PAI-1的影响，以明确TGF-β₁在肝癌发生浸润和转移过程中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β₁和pcDNA3-ASTGF-β₁的构建　质粒转化扩增、提取、酶切和片段回收按文献方法进行^〔5〕。将真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen公司)和pSp65 TGF-β₁用EcoRI酶解，分别回收线性pcDNA3载体和TGF-β₁片段，pcDNA3载体用碱性磷酸酶处理后与TGF-β₁ cDNA片段连接形成重组质粒，筛选转录方向正确和相反的重组体分别命名为pcDNA3-TGF-β₁和pcDNA3-ASTGF-β₁。

　　1.2　SMMC 7721细胞的转染和筛选　取75%融合的SMMC 7721细胞用胰酶消化，预冷的PBS吹打后转移入离心管中，离心，再加入预冷的PBS洗涤1次，离心，再加预冷PBS 0.8 ml，转移入Cuvettes管(Bio-Rad公司)中，加20 μl pcDNA3-TGF-β或pcDNA3-ASTGF-β₁质粒，冰浴5 min，电击(200V，1 000 μF)，冰浴10 min，转移入培养瓶，加20倍体积的10%血清，RPMI1640培养液(Gibco-BRL公司)。48 h后，改用含400 mg/L G418，10%小牛血清，RPMI1640培养液。14天后克隆形成，挑10个单克隆至24孔板，10天后再由24孔板转移至培养瓶，在37℃ CO₂培养箱中培养。

　　1.3　Western blot鉴定转染SMMC7721细胞TGF-β₁表达　亚融合状态的细胞，弃上清，PBS洗2次，加2 ml无血清培养液，48 h后收集上清，离心，上清中加入等量三氯乙酸沉淀，再用0.5 mol/L NaOH溶解沉淀，进行12% SDS-PAGE变性电泳，PVDF膜转移，一抗为兔抗人TGF-β₁多克隆抗体(1∶500，Sant Cruz公司)，二抗为生物素化鼠抗兔IgG(1∶500，华美公司)。

　　1.4　TGF-β₁基因转染的SMMC 7721细胞的鉴定　上述经鉴定表达转染TGF-β₁基因(SMMC-TGF)和反义TGF-β₁(SMMC-ASTGF)的SMMC 7721细胞生长至融合时，用Trizol试剂(Gibco-BRL公司)提取细胞总RNA，取40 μg进行1%变性琼脂糖凝胶电泳和膜转移，紫外线Cross-Linkage固定，α-³²P-dATP(Amersham公司)随机引物法标记TGF-β₁，PAI-1 cDNA探针(由本校分子遗传教研室朱运松教授提供)。按常规方法进行Northern blot杂交。

　　2　结果

　　2.1　重组质粒鉴定　载体pcDNA3经EcoRI酶切后显示5.4 kb片段，重组质粒pcDNA3-TGF-β₁经EcoRI酶切后显示5.4 kb和1.6 kb两个条带；经KpnI酶切后显示0.6 kb和6.4 kb两个条带，而pcDNA3-ASTGF-β₁经EcoRI酶切后显示5.4 kb、1.6 kb两个条带，经KpnI酶切后显示1.0 kb和6.0 kb两个条带。证明TGF-β₁及反义TGF-β₁基因已被正确地重组到pcDNA3载体中(图1)。

图1　重组质粒pcDNA3-TGF-β₁鉴定：①pcDNA3-TGF-β₁质粒EcoRI酶切。②pcDNA3-TGF-β₁质粒Kpnl酶切。③DNA Marker:λDNA(EcoR1+HindⅢ)。④pcDNA3-ASTGF-β₁经EcoRI酶切。⑤pcDNA3-ASTGF-β₁经Kpn I酶切。

　　2.2　TGF-β₁基因和反义TGF-β₁转染SMMC 7721细胞鉴定　Western blot结果显示：与对照组(SMMC 7721)相比，转染反义TGF-β₁基因(SMMC-ASTGF)细胞分泌TGF-β₁蛋白被极大地抑制，而转染TGF-β₁基因(SMMC-TGF2、3、4)细胞分泌TGF-β₁蛋白则比对照组高2倍(图2)。Northern blot结果表明：SMMC-TGF2、3、4和SMMC-ASTGF分别表达较多的2.5 kb TGF-β₁ mRNA和反义TGF-β₁ RNA(图3)。

　　2.3　TGF-β₁对SMMC 7721细胞的PAI-1表达的影响　Northern blot结果显示：与对照组相比，SMMC-TGF2、3、4细胞表达3.2 kb PAI-1 mRNA明显提高，而SMMC-ASTGF细胞表达3.2 kb PAI-1 mRNA明显减少(图3)。

图2　Western blot检测TGF-β₁多肽：①SMMC 7721细胞。②SMMC-TGF1细胞。③SMMC-ASTGF细胞。④SMMC-TGF2细胞。⑤SMMC-TGF3细胞。⑥SMMC-TGF4细胞。

图3　Northern blot检测TGF-β₁和PAI-1 mRNA表达：①SMMC 7721。②SMMC 7721细胞转染pcDNA3。③SMMC-TGF2细胞。④SMMC-TGF3细胞。⑤SMMC-TGF4细胞。⑥SMMC-ASTGF细胞。PAI-1为3.2 kb PAI-1 mRNA, TGF为2.5 kb TGF-β₁ RNA, GAPDH为内参照。

　　3　讨论

　　研究表明，组织型和尿激酶型纤溶酶原激活物(tPA，uPA)介导的纤维蛋白溶解与肿瘤的浸润和转移密切相关，PAI-1作为tPA和uPA的生理抑制剂，通过与tPA和uPA相互作用，参与肿瘤的侵袭性生物学行为^〔7〕。以往研究发现，恶性肿瘤中PAI-1过表达可能与肿瘤增生时的血管生成有关，也有作者认为PAI-1的升高是肿瘤扩散的标志^{〔3，8，9〕}。最近，郑起等在人肝细胞性肝癌和人肝细胞性肝癌裸鼠转移模型中均发现，PAI-1表达明显提高，并证实肝癌过表达PAI-1与其侵袭性和术后复发相关。

　　文献报道^〔5〕，在人的正常肝脏中TGF-β₁ mRNA和蛋白一般无明显表达，只有在肝发生纤维化或硬化时，部分Ito细胞和间质细胞可表达TGF-β₁ mRNA，而肝细胞则始终不表达TGF-β₁ mRNA和蛋白。然而大量研究证明，肝细胞性肝癌细胞可有明确的TGF-β₁ mRNA和蛋白表达。Shirai等^〔10〕也曾报道肝癌病人血浆中TGF-β₁含量上升，并比肝炎和肝硬化患者更为明显增强。同时Tsai等^〔11〕也观察到肝癌病人的尿中TGF-β₁浓度上升，且上升程度与肝癌大小及分布状态相关。大量实验研究表明，体外培养的肝癌细胞也表达TGF-β₁ mRNA和蛋白，并发现TGF-β₁能诱导一部分人肝癌细胞株(如HepG2,Hep3B,HuH-7细胞等)生长抑制或凋亡；而另一部分人肝癌细胞株(如Hep3B-TR细胞)对TGF-β₁却无反应^〔12〕。但TGF-β₁对肝癌细胞生物学行为的影响及作用机制至今未被阐明。本实验采用转基因技术，建立过表达TGF-β₁和低表达TGF-β₁的细胞株，在国内首次观察他们对PAI-1 mRNA表达的影响，从而为进一步阐明TGF-β₁在肝癌发生发展中的作用提供了一个重要实验依据。

　　基金项目：国家“九五”攻关项目(96-906-01-15)、上海市教委重点学科基金及CMB基金(93-583)资助项目

　　作者简介：林文生，男，27岁，博士研究生。研究方向：肾小球硬化机制，肿瘤浸润和转移的机制

　　郭慕依，男，59岁，教授，博士生导师，中华医学会上海分会病理学会委员。研究方向：肾小球疾病诊断及肾小球硬化机制

　　参考文献

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　　3，郑　起，汤钊猷，薛　琼.人肝癌裸鼠转移模型中纤溶酶原激活物抑制物抑制剂变化与肝癌生物学特性.中华外科杂志，1998；36：687～689

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　　10，Shirai Y, Kawata S, Tamura S. Plasms transforming growth factor-β1 in patients with hepatocellular carcinoma comparison with chronic liver diseases. Cancer,1994;73(9):2275～2279

　　11，Tsai JF, Jeng J, Chuang LY et al. Clinical evaluation of urinary transforming growth factor-β1 and serum α-fetoprotein as tumor markers of hepatocellular carcinoma. Br J Cancer,1997;75(10):1460～1466

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收稿日期：1999-11-24