绞股蓝总皂甙诱导人肝癌HepG₂－A₁₆细胞程序性死亡

癌症 1999年第0期第18卷 基础研究

作者：曹建国，周军民，唐小卿，郑兴

单位：衡阳医学院药理教研室（衡阳市421001）

关键词：绞股蓝总皂甙；肝癌；细胞程序性死亡；Bcl－2基因

　　【摘要】目的：探讨绞股蓝总皂甙（Gypenosides,GPS）对人肝癌细胞程序性死亡的影响及机制。方法：采用MTT法和微量琼脂糖培养克隆形成法检测GPS对体外培养人肝癌细胞株（HepG₂－A₁₆）细胞生长增殖和克隆形成能力的抑制作用。应用DNA断片法和TUNEL法观测GPS对HepG2－A₁₆细胞程序性死亡的影响；同时使用S－P免疫组化法观察GPS对HepG₂－A₁₆细胞Bcl－2蛋白表达的影响。结果：1.GPS（50－250mg/L）对HepG₂－A₁₆细胞增殖和克隆形成能力有明显抑制作用（P＜0.05-0.001),呈剂量相关性(P＜0.0千)。2.GPS(50-250mg/L)处理HepG₂－A₁₆细胞24小时后,DNA琼脂糖电泳表现出细胞程序性死亡特征性的梯形条带图谱;TUNEL法染色细胞呈现典型凋亡特征性蓝紫色颗粒。3.S-P免疫组化法检测HepG₂－A₁₆细胞Bcl－2蛋白呈阳性染色;GPS(50mg/L)孵育24小时后Bcl－2蛋白呈阴性染色。结论：GPS具有促进人肝癌细胞程序性死亡作用；GPS诱导人肝癌细胞Bcl－2基因表达下调可能是其促进细胞程序行死亡的主要机制之一。

　　中图号：R979.1　　文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)s0－0017－03

Gypenosides promotes the programmed cell death of human liver carcinoma cells

CAO Jian－ guo， ZHOU Jun－ min， TANG Xiao－ qing, et al.

Department of Pharmacology,Hengyang Medical College,Hengyang 421001,P.R.China

　　【Abstract】Objective:To investigate the effect and the mechanism of gypenosides(GPS) on the programmed cell death(PCD) of human liver carcinoma cell line HepG₂－ A₁₆.Methods:The MTT colorimetric assay and the agarose cultured colony formation micro-method were used to investigate the inhibition effect of GPS on the proliferation and colony formation ability in vitro cultured human liver carcinoma(HepG₂－A₁₆)cells.DNA fragment ation method and TUNEL method were used to observe the effect of GPS on PCD of HepG₂－A₁₆ cells .The influence of GPS on Bcl－2 protein expression of HepG₂－A₁₆ cells was detected by Streptavidin－ peroxidase(S－P)immunohistochemical method.Results:1.GPS(50－ 250 mg/L)inhibted the proliferation and colony formation ability of HepG2－A₁₆ cells in a concentration－dependent manner(P〈0.05-0.001).2.HepG₂－A₁₆ cells treated with GPS(50-250mg/L)for 24 hours showed DNA fragment ladder and bluepurplish grain which are characteristic appearance of PCD by DNA agarose gel electrophoresis and TUNEL staining.3.Bcl－2 protein stain of HepG₂－A₁₆ cells is positive by S-P immunohistochemical method,whereas it is negtive in those treated with GPS(50mg/L)for 24 hours.Conclusions:GPS an promote PCD of human liver carcinoma cell and down-regulation of bcl－2 protein expression mqy be one of the mechanisms which GPS promote PCD of human liver carcinoma cells.

　　Key Words: Gypenosides； Liver carcinoma； Programmed cell death； bcl－2 gene.

　　绞股蓝总皂甙(GPS)对体外培养肝癌细胞DNA合成和蛋白质合成有抑制作用〔1〕。我们也曾报道GPS具有抑制人急性粒细胞性白血病细胞增殖和促进细胞程序性死亡的作用〔2〕。本文采用MTT法和微量琼脂糖培养克隆形成法检测GPS对体外培养人肝癌（HepG₂－A₁₆）细胞增殖的影响，同时应用DNA断片法、末端标记(TUNEL)法和链霉菌亲和物素蛋白－生物素酶标（S－P）免疫组化法观察GP巧对HepG₂－A₁₆细胞程序性死亡和Bcl－2蛋白表达的影响。

　　1材料与方法

　　1．1细胞

　　人肝癌（HepG₂－A₁₆）细胞由湖南医科大学肿瘤研究所细胞中心引入我室，用含10％小牛血清（FCS）的M199培养基培养，取对数生长期细胞用于实验。

　　1．2药物

　　GPS纯度为85％，原料产地：湖南绥宁县，由湖南医药工业研究所提供；氟脲嘧啶（上海十二制药厂5－FU）；PBS液稀释，过滤除菌，分装使用。

　　1．3MTT法测定

　　实验在96孔培养板中进行，每孔加入200μl单细胞悬液（每孔约2×104个细胞）；每孔继加入GPS实验液10μl（终浓度为5，25，50，100，250mg/L）同时设置阳性药物对照组（5－FU60mg/L）、溶媒对照组及调零组（仅加等量的PBS液），每组4孔；二氧化碳培养箱培养48小时后吸去上清液，实验组及对照组每孔加入100μlMTT溶液（1.207mmol/L），调零组加入无血清M199培养基，混匀，继续培养6小时，弃上清液，每孔加入100μl二甲亚砜（DMSO）溶液，震荡，使紫蓝色沉淀充分溶解，在(DG－3020型酶标仪下，用调零孔校正零点，以570nm波长测定A值。以4孔A值均数按下列公式计算相对抑制率（IR）：

　　IR=（1－实验组A值/对照组A值）×100％

　　重复三批实验。

　　1．4微量琼脂糖克隆形成法测定

　　用0．25％胰蛋白酶消化细胞，用含20％小牛血清M199培养液制备单细胞悬液，胎盼蓝染色计数活细胞，调节细胞浓度为每毫升105个细胞。取0．1ml单细胞悬液、0．1ml药物或PBS、0．7ml含20％FCS的M199培养基、0．1ml2％琼脂糖配制为1．0ml的培养体系；将培养体系加入96孔细胞培养板，每孔100μl，每组设置3个复孔。置二氧化碳培养箱中培养10天，显微镜下计数克隆数。克隆标准：＞50个细胞或直径＞60um的细胞团块。以3孔克隆均数按下列公式计算克隆抑制率：

　　克隆抑制率=（1－实验组克隆数/对照组克隆数）×100％

　　重复二批实验。

　　1．5DNA断片法测定

　　参照Wesselborg等〔3〕的方法进行。将药物处理后及对照组细胞用PBS液制成单细胞悬液，调节浓度为每毫升5×106个细胞，常规酚/氯仿法提取DNA，1.2％琼脂糖凝胶电泳后，置紫外光下观察DNA断片并照相。用密度扫描仪(ZEISS全自动图像分析仪，VIDAS数据分析)测定梯型条带的面积和灰度，计算梯型条带曲线下面积占总面积的百分比进行半定量分析。

　　1．6TUNEL法测定

　　经药物处理后及对照组细胞制成单细胞悬液，调节细胞浓度为5×106个细胞，制备细胞涂片（4％多聚甲醛固定）；然后按试剂盒说明书操作。显微镜下计数1000个细胞中含有蓝紫色颗粒细胞所占的百分比为凋亡率。

　　以上实验重复二次。

　　1．7Bcl－2蛋白免疫组化染色

　　药物处理后及对照组细胞用PBS液制成单细胞悬液，调节细胞浓度每毫升2×106个细胞，滴片，室温下自然干燥，然后按试剂盒说明书进行操作。

　　1．8统计学处理

　　接种细胞数与A值和克隆数的关系用直线回归分析；药物处理后A值和克隆数结果用±s表示，方差齐性检验后行方差分析，两组均数比较用q检验。

表1　MTT法测定GPS对HepG₂－A₁₆细胞相对抑制率

药物	浓度（mg/L）	A/570(±s)	相对抑制率(％)
PBS	0.00	1.025±0.293	——
5－FU	60.00	0.225±0.001b	78.05
GPS	5.00	0.547±0.064a	46.59
GPS	25.00	0.390±0.104a	61.95
GPS	50.00	0.282±0.065b	72.44
GPS	100.00	0.232±0.012b	77.32
GPS	250.00	0.180±0.001b	82.44

　　注：与溶媒(PBS)对照组比较a示P＜0.01,b示P＜0.001

　　2结果

　　2．1GPS对HepG₂－A₁₆细胞增殖的影响

　　HepG₂－A₁₆细胞在每孔接种细胞数1.25～20.0×105范围内与A值呈线性相关，相关系数是0.966（P＜0.001)。表1示：GPS对HepG₂－A₁₆细胞生长增殖具有抑制作用，呈剂量相关性；IC₅₀值是9.23mg/L，95％平均可信限为9.23±1.32mg/L。

　　2．2GPS对HepG₂－A₁₆细胞集落形成能力的影响

　　HepG₂－A₁₆细胞在每孔接种细胞数1.25－20.00×102范围内与克隆数呈线性相关，相关系数为0.972（P＜0.01)。GPS具有抑制HepG₂－A₁₆细胞克隆形成能力的作用，且呈剂量依赖性，IC₅₀值是44.94mg/L，95％平均可信限为44.94±6.47mg/L,见表2。

　　2．3GPS对HepG₂－A₁₆细胞程序性死亡程度的影响

　　2．3．1DNA断片法测定GPS(50,100,200,250mg/L)作用24小时后表现出明显的DNA“梯型条带”图谱，梯型条带曲线下面积占总面积的百分比分别为73.8％、73.6％、74.2％、91.4％，较溶媒(PBS)对照组(16.4％)明显升高(P〈0.01)

　　2．3．2TUNEL法测定经GPS(50,250mg/L)处理24小时后，TUNEL染色HepG₂－A₁₆细胞呈现特征性蓝紫色颗粒，显微镜下计数1000个细胞中含有蓝紫色颗粒细胞所占的百分比为凋亡率，凋亡率分别是37.5％、46.3％，较溶媒(PBS)对照组(6.7％)增高(P＜0.05)

　　2．4HepG₂－A₁₆细胞Bcl－2蛋白S－P免疫组化法染色

　　未加GPS的对照组细胞Bcl－2蛋白染色为中等阳性，细胞染成棕褐色；而GPS（50.0mg/L）处理的实验组细胞Bcl－2蛋白染色为阴性；表明GPS具有下调Hep2－A16细胞Bcl－2蛋白表达的作用。

表2　GPS对HepG₂－A₁₆细胞的克隆抑制率

药物	浓度(mg/L)	每孔克隆数(±s)	克隆抑制率(％)
PBS	0	18±1	——
5－FU	60	2±1**	88.95
GPS	5	16±2	8.25
GPS	25	14±2	19.26
GPS	50	8±1*	55.97
GPS	100	6±1**	66.98
GPS	250	2±0***	85.31

　　注：与溶媒(PBS)对照组比较＊示P＜0.05＊＊示P＜0.01＊＊＊示P＜0.001

　　3讨论

　　绞股蓝总皂甙是从葫芦科绞股蓝属（Gynostem mapentaphyllumMakino)植物中提取获得的皂甙类混合物。已证实对体外培养的人肝癌细胞DNA和蛋白质合成具有抑制作用〔1〕。我们也曾报道绞股蓝总皂甙抑制人急性粒细胞性白血病细胞增殖和促进细胞程序性死亡〔2〕。我们的实验结果进一步证实绞股蓝总皂甙能有效抑制人肝癌（HepG₂－A₁₆）细胞的生长增殖。

　　细胞程序性死亡是细胞死亡的重要形式之一。1980年Wyllie等首次发现胸腺细胞程序性死亡存在DNA特征性断裂，目前认为与内源性限制性内切酶被激活有关，该酶选择性切断核小体间的DNA链，从而产生180－200bp及其多倍体的不连续DNA碎片，在琼脂糖凝胶上电泳呈“梯型(ladder)条带”，这是判断细胞程序性死亡的重要生化指标〔4〕。本实验结果可以看到：绞股蓝总皂甙（50－250mg/L）作用24小时后，DNA断片法观察呈典型细胞程序性死亡特征性“梯型条带”图谱；末端标记法(TUNEL)亦显示凋亡率明显增高。表明：绞股蓝总皂甙具有促进人肝癌（HepG₂－A₁₆）细胞程序性死亡作用。

　　已经证实Bcl－2蛋白促进细胞生存是由抑制细胞程序性死亡而实现的〔5〕。我们用S－P免疫组化染色法检测了绞股蓝总皂甙作用于HepG₂－A₁₆细胞前后的bcl－2蛋白表达状况，结果发现：绞股蓝总皂甙可诱导Bcl－2蛋白低表达。从而揭示：绞股蓝总皂甙通过下调Bcl－2基因表达进而促进细胞程序性死亡是其抗肿瘤作用机制之一。

　　基金项目：湖南省自然科学基金资助课题NO：9559311

　　〔参考文献〕

　　1　陈葳,李广元.绞股蓝总皂甙对体外培养肝癌细胞核酸和蛋白质合成的影响〔J〕.西安医科大学学报,1993,14(1)：14

　　2　曹建国,周军民,黄红林等.绞股蓝总皂甙对人急性粒细胞性白血病细胞增殖和程序性死亡的影响〔J〕.亚洲医药,1997,(5)：35

　　3　李宁丽,沈佰华.DNA断端标记法分析HL－60和U937白血病细胞株细胞凋亡〔J〕.肿瘤,1996,16(3)：391

　　4　Wyllie AH. Glucocoticiod－ induced thynocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activeation〔 J〕 .Nature,1980,284：555

　　5　Miyashital T,Reed JC.Bcl－ 2 oncoprotein blocks chemtherapy－ inducede apoptosis a human leukemia cell line〔 J〕 .Blood,1993,11：151

收稿日期：1998－12－18;修回日期：1999－03－04