B7-1分子增强NK细胞对肝癌细胞毒活性的体外研究
癌症 1999年第5期第18卷 基础研究
作者：黄嘉凌 吕明德 肖定璋 李树浓
单位：黄嘉凌 吕明德 肖定璋,中山医科大学附一院肝胆外科(广州，510080)；李树浓，中山医科大学病理生理教研室
关键词：肝肿瘤；NK细胞；CD80；基因疗法；体外研究
【摘 要】 目的：了解B7-1分子在体外抗肝癌免疫反应中对自然杀伤细胞(NK细胞)杀伤活性的影响。方法：经脂质体DOSPER介导将hB7-1基因直接导入HepG2细胞，建立HepG2/hB7-1细胞克隆。分离健康人和肝癌患者外周血淋巴细胞，以MTT法测定NK细胞对HepG2/hB7-1细胞的杀伤活性，以杀伤HepG2/neo和HepG2细胞为对照。结果：HepG2细胞转染hB7-1基因后表达B7-1分子。无论在健康人组还是肝癌患者组，健康人外周血NK细胞杀伤HepG2/neo，HepG2细胞的活性约为肝癌患者NK活性水平的2倍。健康人和肝癌患者外周血NK细胞对HepG2/hB7-1细胞的杀伤活性均较对照组明显增高(增强1.49～3.48倍)，对HepG2/hB7-1细胞的杀伤活性在E/T=5∶1时分别为57.2及43.8，有显著性差异(P＜0.05)，在E/T=10∶1及20∶1时分别可达82.8～84.4和78.6～86.4，差异不显著(P＞0.05)。结论：B7-1分子显著增强NK细胞对肝癌细胞的体外杀伤活性，可能通过激活非特异性细胞免疫在抗肝癌复发中发挥作用。
中图分类号：R735.7，R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0528-03
In vitro study on the role of B7-1 molecule in cytotoxicity of natural killer cells against hepatocellular carcinoma
HUANG Jia-ling,LU Ming-de,XIAO Ding-zhang,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Sun Yan-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,P.R. China
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of B7-1 expression on cytotoxicity of human natural killer cells (NK cells) against hepatocellular carcinoma (HCC) cells in vitro.Methods：Human B7-1 gene was directly transduced into HepG2 cells in presence of DOSPER to establish HepG2/hB7-1 cell clone. Peripheral blood lymphocytes (PBL) were seperated from healthy donors and HCC patients' blood and subjected to test NK cytotoxicity by detecting their ability to lyse HepG2,HepG2/neo and HepG2/hB7-1 cells by MTT dye method.Results：HepG2/hB7 1 cell clone was established through direct B7-1 gene transfer,which strongly expressing B7-1 molecules. NK cytotoxicity against HepG2,HepG2/neo in healthy donors' PBL was about 2 times much as that of in HCC patients' PBL. NK cytotoxicity in healthy donors' and HCC patients' PBL against HepG2/hB7-1 cells were 2.23～3.48 and 1.49～ 2.14 times higher than that of lysing HepG2/neo cells,respectively (P＜0.001). NK cytotoxicity ability in HCC patients' PBL against HepG2/hB7-1 cell was 43.8,lower than that of healthy donors' (57.2) at E/T=5∶1,while E/T=10∶1,20∶1,they reached 78.6～86.4,as much as the same of healthy donor' s 82.8～84.4, no statistical significance was found (P＞0.05).Conclusions：B7-1 molecules strongly enhance NK cytotoxicity against hepatocellular carcinoma cells in vitro.
Key words：Liver neoplasms；CD80；Natural Riller cells；Gene therapy
近年研究结果表明，B7分子除能为T细胞提供活化增殖及发挥效应所必需的第二信号外，还能促进鼠自然杀伤细胞(NK细胞)的增殖，增强NK细胞对头颈部鳞癌，黑色素瘤，淋巴瘤及肺癌等肿瘤的杀伤活性〔1～4〕。B7分子能否促进人NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性，尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒和细胞：编码人B7-1分子的逆转录病毒表达载体pLXSN-hB7-1质粒由意大利Dr.MarioP.Colomobo惠赠，空载体pLXSN由陈永雄博士惠赠。人肝癌细胞株HepG2从中国科学院上海细胞生物研究所引进。
主要试剂和仪器：DOSPER脂质体转染试剂盒，G418购自德国Boehringer Mannheim(BM)公司。牛血清白蛋白，DMEM，RPMI1640购自美国GIBCOBRL公司。FITC标记的兔抗人anti-CD80单抗购自美国Pharmingen公司。叠氮钠，MTT为Sigma公司产品。Ficoll-Hypaque购自上海试剂二厂。其余试剂为国产分析纯产品，96孔培养板为Corning公司产品。DG-3022型酶联仪，南京电子试管厂产品。流式细胞仪，美国Coulter公司产品。
肝素抗凝人外周新鲜血来自健康献血者6人(均为男性)和肝细胞肝癌患者6人(男5例，女1例，病变均由病理学证实)。
1.2 实验方法
1.2.1 pLXSN-hB7-1质粒DNA直接转染HepG2细胞：按照DOSPER脂质体转染试剂盒说明书进行，以转染空载体pLXSN-neo作对照，以G418500μg/ml筛选一个月。
1.2.2 HepG2细胞表现B7-1分子表达的检测：消化对数生长期的HepG2/hB7-1，HepG2/neo及HepG2细胞，以缓冲液(含0.1％叠氮钠，0.2％牛血清白蛋白的PBS)洗一次后悬浮于缓冲液，配成1×106/ml。吸取1ml细胞加入1.5ml Eppendorf管中，加入15μlanti-CD80单抗，4℃孵育30分钟。以不加单抗孵育为对照。用缓冲液洗3次后以1％多聚甲醛0.5ml固定，用流式细胞仪检测B7-1分子的表达。
1.2.3 分离健康人和肝癌患者外周血淋巴细胞：将健康人和肝癌患者肝素抗凝外周新鲜血以生理盐水稀释一倍，取5ml沿管壁缓慢加入预先加有Fi-coll-Hypaque的10ml离心管中，2500rpm离心20分钟。吸出淋巴细胞层至另管，用生理盐水洗2遍后悬于完全RPMI1640中，配成1×106/ml。
1.2.4 NK细胞活性测定〔5〕：将靶细胞HepG2/hB7-1按104/孔接种至96孔板，按E/T=5∶1，10∶1，20∶1加入淋巴细胞，37℃，5％CO2孵育4小时后加入5mg/mlMTT15μl，再孵育4小时。加入溶解液，37℃水浴2小时后振荡混匀，在酶联仪上测定OD570，按以下公式计算NK细胞活性。以杀伤HepG2/neo，HepG2细胞的活性作对照。
1.2.5 统计学处理：数据以
表示，用SAS软件进行方差分析，检验水准取α=0.05(双侧)。
2 结果
在DOSPER脂质体介导下，以B7-1基因直接转染HepG2细胞成功地建立了表达B7-1分子的HepG2/hB7-1细胞克隆。流式细胞仪检测结果显示，HepG2细胞表面无B7-1分子表达，转染B7-1基因后获得较强的B7-1分子表达，阳性细胞率在90％以上(图1)。
图1 流式细胞仪检测细胞表面B7-1分子表达
A：HepG2细胞；B：HepG2/hB7-1细胞
健康人NK细胞杀伤对照靶细胞HepG2/neo，HepG2的活性接近，差异无统计学意义(P＞0.05)。肝癌患者外周血NK细胞杀伤两组对照靶细胞的活性也无显著差异(P＞0.05)。但肝癌患者和健康人外周血NK细胞杀伤对照靶细胞的活性分别为16.2％～26.3％和29.8％～52.2％，前者约为后者的一半(P＜0.01)。健康人和肝癌患者外周血NK细胞杀伤HepG2/hB7-1细胞的活性分别比相应对照组增强2.23～3.48和1.49～2.14倍；其中在E/T=5∶1时健康人NK细胞活性比肝癌患者的高30.6％，而在E/T=10∶1，20∶1时肝癌患者外周血NK细胞活性达到了健康人水平，对比无显著性差异(P＞0.05，表1)。
表1 B7分子对NK细胞活性的影响
|
淋巴细胞来源 |
例数 |
E/T |
HepG2 |
HepG2/neo |
HepG2/hB7-1 |
|
健康人 |
6 |
5∶1 |
29.8±0.2 |
38.5±0.6 |
57.2±5.1＊ |
| |
10∶1 |
38.5±1.1 |
39.0±0.4 |
82.8±0.4＊ |
| |
20∶1 |
52.2±1.8 |
51.6±1.2 |
84.4±10.0＊ |
|
肝癌患者 |
6 |
5∶1 |
16.2±2.1 |
19.6±2.1 |
43.8±1.4＊ |
| |
10∶1 |
22.7±2.3 |
14.8±0.4 |
86.4±3.6＊ |
| |
20∶1 |
26.3±3.2 |
22.5±2.5 |
78.3±3.8＊ |
e/T：效/靶比。＊与E/T相同HepG2,HepG2/neo细胞组NK活性比较
3 讨论
T细胞和NK细胞是抗肿瘤免疫反应的主要效应细胞，B7共刺激分子在T细胞的活化及发挥杀伤效应中起重要作用〔6〕，我们已在体外实验中发现B7-1分子能增强肝癌细胞的免疫原性，增强T细胞特异杀伤肝癌细胞的活性〔7〕。至于B7分子对NK细胞活性的影响，研究不多，尚有争论。
Nandi等发现人和鼠NK细胞表达B7分子，体外实验表明B7/CD28相互作用也能为NK细胞增殖提供共刺激信号，使NK细胞达到最强增殖，但NK细胞的杀瘤活性并不增强〔1〕。其他的文献则报告B7分子不但能促进NK细胞的增殖，而且在NK细胞杀伤活力及细胞因子的产生中起着促进作用〔2，3〕。Yeh将B7/L1.2.7.12及亲本细胞接种至不同裸鼠的皮下，结果显示B7分子可显著增强NK细胞体内抗瘤能力〔4〕。本研究发现肝癌者外周血NK细胞活性较正常人的低，提示肝癌患者非特异性免疫功能下降。NK细胞含嗜天青颗粒，抗肿瘤作用无需抗原刺激，无MHC限制，亦无需补体参与，能在特异性杀伤T细胞产生之前即杀伤肿瘤细胞，是机体抗肿瘤的天然的第一道防线。肝癌患者术后易复发可能与NK细胞活性下降有关〔8〕。Yeh等认为NK细胞在抗低免疫原性肿瘤中较特异T细胞起更重要的作用〔4〕，肝癌是弱免疫原性肿瘤，因此增强NK细胞活性对减少肝癌复发具有重要意义。本研究结果表明，B7分子存在的情况下NK细胞活性大大增强，而且E/T=10∶1及20∶1时肝癌患者外周血NK活性可达到正常人水平。E/T=5∶1时肝癌患者NK细胞杀伤HepG2/hB7-1细胞的活性仍低于正常人水平则可能与效应细胞数量相对不足有关。结合我们以往的研究，由于B7分子能够活化NK细胞的杀瘤活性，增强肝癌细胞的免疫原性和T细胞的杀伤活力，B7分子诱导的抗肝癌免疫可望在肿瘤的不同阶段均发挥有力的抗癌效果。
基金项目：本课题受广东省科委自然科学基金资助(编号970066)
参考文献
〔1〕 Nandi D,Gross JA,Allison JP. CD28-mediated costimulation is necessary for optimal proliferation of murine NK cells〔J〕. J Immunol,1994,152(7):3361～3369.
〔2〕 Chambers BJ,Salcedo M,Ljunggren HG. Triggering of natural killer cells by the costimulatory molecule CD80 (B7-1)〔J〕. Immunity,1996,5(4):311～317.
〔3〕 Wu TC,Huang AY,Jaffee EM,et al.A reassessment of the role of B7-1 expression in tumor rejection〔J〕. J Exp Med,1995,182(5):1415～1421.
〔4〕 Yeh KY,Pulaski BA,Woods ML,et al.B7-1 enhances natural killer cell-mediated cytotoxicity and inhibits tumor growth of a poorly immunogenic murine carcinoma〔J〕.Cell Immunol,1995,165(2):217～224.
〔5〕 Dessueault S,Gallinger S. Allogeneic lymphocytes responses to B7-1 expressing human cancer cell lines〔J〕. J Surg Res,1996,64(1):42～48.
〔6〕 Chen LP,Ashe S,Brady WA,et al.Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4〔J〕.Cell,1992,71:1093～ 1102.
〔7〕 肖定璋，吕明德，黄嘉凌，等.表达B7分子的HepG2细胞克隆的建立及其免疫原性的研究〔J〕.中国免疫学杂志，1997，13：9.
〔8〕 Tabor E. Liver tumors and host defense〔J〕. Semin Liver Dis,1997,17(4):351～355.
收稿日期：1998-10-09；修回日期：1998-12-21
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