IGF-I、IGF-II及其受体在肝癌和癌旁肝组织中的表达
癌症 2000年第2期第19卷 基础研究
作者：范子荣 杨冬华 覃汉荣 徐重 邱庆林
单位：范子荣（第一军医大学珠江医院消化科,广东 广州 510282）；杨冬华（第一军医大学珠江医院消化科,广东 广州 510282）；覃汉荣（第一军医大学珠江医院消化科,广东 广州 510282）；徐重（第一军医大学珠江医院消化科,广东 广州 510282）；邱庆林（第一军医大学珠江医院消化科,广东 广州 510282）
关键词：肝细胞癌；IGF-I；IGF-I受体；IGF-II；IGF-II受体；原位杂交
【摘 要】目的：探讨胰岛素样生长因子I、II及其受体在肝癌和癌旁肝组织中的表达及其意义。方法：采用DNARNA原位杂交方法检测肝癌和癌旁肝组织中IGF-I、IGF-II及其受体mRNA的表达。结果：在肝癌组织中IGF-I、IGF-I受体、IGF-II、IGF-II受体mRNA的表达率分别为40.0％、46.7％、66.7％和63.3％，在癌旁肝组织中IGF-I、IGF-I受体、IGF-II、IGF-II受体mRNA的表达率分别为46.7％、53.3％、70.0％和73.3％，有36.7％的肝癌和50.0％的癌旁肝组织同时表达四种mRNA。IGF-I、IGF-II及其受体mRNA在分化较差的肝癌细胞、肝细胞再生结节和不典型增生肝细胞中阳性信号最强。结论：IGF-I、IGF-II及其受体在肝细胞癌变过程中发挥重要作用，肝癌的发生发展与IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的协同作用有关。
中图分类号：R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)02-0150-03
Expressions of IGF-I,IGF-II and their receptor mRNAs in hepatocellular carcinomas and adjacent non-tumor tissues
FAN Zi-rong YANG Dong-hua QIN Han-rong et al
（Department of Gastroenterology, Zhujiang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510282,P.R. China）
【Abstract】 Objective: To clarify the clinical significance and effect of the expression of IGF-I，IGF-II and their receptors in hepatocellular carcinomas (HCC) and adjacent non-tumor tissues. Method: In situ hybridization was used to detect the mRNAs for IGF-I， IGF-II and their receptors in HCC and adjacent non-tumor tissues. Results:The expressions of IGF-I, IGF-IR, IGF-II, and IGF-IIR mRNA were detected in 40.0％ , 46.7％ , 66.7％ and 63.3％ , respectirely in HCC. Positive hybridization signals of IGF-I, IGF-IR, IGF-II, and IGF-IIR mRNA were found in 46.7％ , 53.3％ , 70.0％ , and 73.3％ of adjacent non-tumor tissues.The liver cell dysplasia and poorly differentiated HCC cells were stained strongly positive. Conclusion:Coordinate overexpression of IGF-I, IGF-II and their receptors might play an important role in the formation and development of HCC.
Key words：Hepatoma; IGF-I; IGF-I receptor; IGF-II ; IGF-II receptor; In situ hybridization
胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors,IGFs）包括IGF-I、IGF-II两个基本成员，与它们相结合的受体有IGF-IR、IGF-IIR。IGF-II是一种强烈的致有丝分裂剂，具有刺激细胞增殖与分化的作用，许多研究表明，IGF-II、IGF-IIR与肝癌的发生发展密切相关，但它们的具体作用机制尚不完全明确[1]。IGF-I、IGF-IR虽然参与了许多肿瘤的发生和生长[2,3]，但在肝细胞癌变过程中有无表达，以及IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR之间是否存在协同作用均不清楚。本研究采用原位杂交方法，分析IGF-I、IGF-II及其受体在肝癌和癌旁肝组织中的表达状况及其作用，为肝癌形成的分子机制研究和临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1标本：30例肝细胞癌来源于中山医科大学肿瘤医院腹科、第一军医大学南方医院肝胆外科和珠江医院消化科，按Edmondson分级法：I级2例，II级4例，III级21例，IV级3例。所有标本均带有癌旁肝组织，其中12例经病理学证实存在肝细胞不典型增生（livercelldysplasia，LCD）。用作对照的正常肝组织取自肾移植供者（肝组织结构正常，血清HBV标志物阴性）。胎肝组织取自水囊引产的正常胎儿肝脏（孕20周）。
1.1.2 主要试剂：多聚甲醛、甘氨酸、Tris、EDTA、多聚赖氨酸、甲酰胺、DEPC、RNaseA、蛋白酶K、硫酸葡聚糖、聚蔗糖、牛血清白蛋白（Sigma公司）。寡核苷酸地高辛加尾标记和检测试剂盒(宝灵曼公司)。
1.1.3探针：IGF-I、IGF-IR、IGF-II和IGF-IIR寡核苷酸探针由我们自行设计，上海生化所合成。探针序列:IGF-I 5’-GAGCTGTGATCTAAGGAGGCTG-GAGATGTATTGCGCACCC-3'；IGF-IR5’-ATCTTAC-TACATGGGCTGAAGCCCTGGACTCAGTACGCCC-3’；IGF-II 5’-GTGCTTCTCACCTTCGCCTTCGCCTCGTG-CTGCATTG-3'；IGF-IIR 5’-ACAATGCCTGTCTGTGG-GACCATCCTGGGAAAACCTGTCT-3’。探针采用寡核苷酸地高辛加尾标记法标记。
1.2 方法
1.2.1 组织固定、切片：新鲜标本立即置入4％多聚甲醛中室温固定12h，0.1mol/LPBS(pH7.4)冲洗3次，按原位分子杂交要求进行石蜡包埋、切片（5μm厚）。
1.2.2 原位杂交步骤：常规脱蜡、水化，0.2％TritonX100室温15min，30mg/L蛋白酶K37℃消化30min，0.2mol/L盐酸室温10min，0.1mol/L甘氨酸（pH7.4）室温终止酶作用20min，预杂交（40℃，2h），杂交（40℃，16h）。洗涤：2×SSC（40℃，20min），0.5×SSC（40℃，60min），Buffer1（01mol/L马来酸，0.15mol/LNaCl）室温15min，Buffer2（阻断剂：Buffer1=1∶9）室温30min。抗地高辛抗体（1∶500）室温孵育2h，NBTBCIP显色3～6h，核固红复染胞核，脱水、透明、封片，光镜下观察结果。
1.2.3 对照：用正常肝组织作阴性对照，胎肝组织作阳性对照，杂交液中不含探针作空白对照。
1.2.4统计学分析：应用SPSS软件进行统计学处理，样本间阳性率的比较采用χ2检验，例数较少的样本采用四格表确切概率法。
2 结果
2.1 IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR mRNA在肝癌和癌旁肝组织的表达、形态及分布
30例肝癌和癌旁肝组织中IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIRmRNA的表达见表1。
表1 肝癌和癌旁肝组织IGF-I、IGF-IR、IGF-II、
IGF-IIR mRNA的表达
| 组织 |
n |
IGF-Ⅰ |
IGF-Ⅰ |
RIGF-Ⅱ |
IGF-ⅡR |
*IGFs |
| 肝细胞癌 |
30 |
12 |
14 |
20 |
19 |
11 |
| 癌旁肝组织 |
30 |
14 |
16 |
21 |
22 |
15 |
| 合计 |
60 |
26 |
30 |
41 |
41 |
26 |
＊IGFs：表示同时表达IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR mRNA IGF-I、IGF-IR mRNA阳性细胞分布不均匀,多呈散在片状或灶状分布；IGF-II、IGF-IIR mRNA阳性细胞均呈弥漫分布。紫蓝色阳性杂交信号均位于胞浆,按其分布形态可分为核周型和全胞浆型。在癌旁肝组织中，较强的杂交信号主要见于肝细胞再生结节和肝细胞不典型增生灶，在肝癌中阳性细胞多见于分化较差的癌细胞（图1～4）。
图1 癌旁肝组织中IGF-IImRNA的表达 ISH×100
图2 癌旁肝组织中IGF-IIRmRNA的表达 ISH×100
图3 肝细胞癌中IGF-ImRNA的表达 ISH×400
图4 肝细胞癌中IGF-IRmRNA的表达 ISH×400
2.2 IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR mRNA的表达与癌旁肝细胞不典型增生的关系
IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIRmRNA在癌旁肝组织中的表达与是否伴有肝细胞不典型增生有关，伴有肝细胞不典型增生的癌旁肝组织，其IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIRmRNA的表达率明显高于不伴有肝细胞不典型增生的癌旁肝组织的表达率。（见表2）
表2 IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR mRNA的表达
与癌旁LCD的关系
| LCD |
n |
IGF-Ⅰ |
IGF-Ⅰ |
RIGF-Ⅱ |
IGF-ⅡR |
| 有 |
12 |
11 |
10 |
11 |
11 |
| 无 |
18 |
3 |
2 |
9 |
8 |
| P值 |
|
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.05 |
＜0.01 |
3 讨论3.1 癌旁肝组织中IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的表达及其意义
在癌旁肝组织中，IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的表达与是否伴有肝细胞不典型增生有关，进一步的细胞定位表明在肝细胞再生结节和肝细胞不典型增生中存在IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的高表达。肝细胞再生结节和肝细胞不典型增生是肝癌的癌前病变之一，IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR在肝细胞癌变前期即开始有过量表达，表明它们的过表达是肝癌发生的早期事件，与肝细胞癌变演化过程关系密切。肝细胞不典型增生是癌前期的细胞变化，细胞增殖较为活跃，伴有肝细胞不典型增生的癌旁肝组织内IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的大量表达，可能通过自分泌或旁分泌生长刺激机制，进一步促进癌前期肝细胞的异常增殖与分化，增加了癌前肝细胞突变的机率，并在一定条件下加速其恶性转化，最终发生肝细胞的癌变[4,5]。
3.2 肝癌组织中IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR的表达及其意义
我们的研究结果表明，IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR在肝癌组织中存在异常的过表达，提示肝癌细胞可能通过自分泌大量的IGF-I、IGF-II直接作用自身或邻近癌细胞的IGF-IR或IGF-IIR，产生胞浆内循环短路，放大了细胞持续生长信号的传递，加速了肝癌细胞的自主性生长，维持其恶性表型[6,7]。此外，在分化较差的肝癌细胞中可见较强的IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR mRNA表达，提示它们的表达与肝癌细胞的分化程度有关，可作为肝癌细胞分化的一种标志，对临床判断肝癌病变的预后有一定的意义[8,9]。
3.3 IGFs及其受体的共同表达与肝细胞癌变的关系
近年来的研究证实，IGF-I通过与IGF-IR结合发挥其生物学效应，但IGF-II的结合却具有双重性，它不仅与IGF-IIR结合，还能与IGF-IR结合而起作用[10]。本组资料有36.7％的肝癌和50.0％的癌旁肝组织同时存在IGF-I、IGF-IR、IGF-II、IGF-IIR mRNA的表达，4种基因在同一份肝癌或癌旁肝组织的同时过量表达，提示IGFs在细胞内的传递具有多途径和反应的多样性。IGF-I、IGF-II通过与其配体的相互作用，在癌旁肝组织中，进一步加速了癌前肝细胞的无限制生长和恶性转化，在肝癌组织中则维持了肝癌细胞的恶性生长特性，表明肝癌的发生发展可能与IGF-I、IGF-II、IGF-IR、IGF-IIR的协同作用有关，也证明了肝癌的发生发展是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程。
基金项目：本课题受国家自然科学基金（No:39470774）资助
通讯作者：范子荣：Tel：86－20－85143361
E-mail：fanzr@fimmil.edu.cn
[参考文献]
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收稿日期:1999－06－16;修回日期:1999－07－20
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