多种药物对肝癌细胞端粒酶活性的影响

癌症 2000年第4期第19卷 快速报道

作者：孟志强　宋明志　黄雯霞　于尔辛

单位：孟志强　宋明志　黄雯霞　于尔辛（上海医科大学肿瘤医院肝科，上海　200032）

关键词：肝脏肿瘤；端粒酶；化学疗法；干扰素

　　【摘要】目的：观察几种在肝癌治疗中常用的药物对肝癌细胞SMMC-7721端粒酶活性的影响，进一步探讨它们的抗癌作用机制。方法：利用化疗药物顺铂、丝裂霉素C、阿霉素、5-氟尿嘧啶、干扰素、全反式维甲酸、叠氮胸苷处理肝癌细胞，然后使用TRAP方法观察处理前后端粒酶活性的变化，同时利用流式细胞术观察细胞周期和凋亡。结果：化疗药物顺铂和丝裂霉素C对肝癌细胞端粒酶活性有抑制作用，流式细胞术检测表明当端粒酶活性受到抑制时，细胞阻滞在G0/G1期，检测表明端粒酶活性的抑制出现在凋亡之前。干扰素对端粒酶活性亦有抑制作用，抑制时细胞阻滞在S期。而阿霉素、5-氟尿嘧啶、全反式维甲酸和叠氮胸苷无抑制作用。结论：对端粒酶活性的抑制可能是化疗药物顺铂、丝裂霉素C和干扰素发挥抗癌治疗的机制之一。

　　中图分类号：R735.705　文献标识码：A　文章编号：1000－467X(2000)04－0317－04

The effects of different drugs on telomerase activity of liver cancer cell

MENG Zhi-qiang　SONG Ming-zhi　HUANG Wen-xia　et al.

　　（Department Hepatology， Cancer Hospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200032,P.R.China）

　　【Abstract】 Objective： To investigate the anti-cancer mechanism of several drugs that often used in liver cancer treatment by studying its effects on telomerase. Methods： The changes of telomerase activity of SMMC-7721 cell following treatment of chemotherapeutic drugs (cisplatin, mitomycin-C, doxorubicin, or 5-fluorouracil),interferon, all-trans-retinoic-acid or AZT were observed by using TRAP method. We also determined apoptosis and cell cycle by FCM at the same time. Results: Chemotherapeutic drugs cisplatin, mitomycin C inhibited telomerase activity. FCM results showed that G0/G1 were arrested after treatment of cisplatin and mitomycin C when telomerase activity was inhibited, and the inhibition happened before apoptosis. Interferon also inhibited the telomerase activity in SMMC-7721 cell, but the cells were arrested in phase S, while doxorubicin, 5-fluorouracil, ATRA and AZT showed no significant inhibition on the telomerase. Conclusions: The inhibition of telomerase activity may be one of the mechanisms of anti tumor activity of chemotherapeutic drug cisplatin, mitomycin C and interferon in liver cancer treatment.

　　Key words： Liver carcinoma； Telomerase； Chemotherapy； Interferon

　　大多数真核动物的细胞在体内不能无限分裂，因此正常细胞有一个有限的复制生命期。但大多数恶性肿瘤细胞表现出无限的分裂过程，说明恶性肿瘤细胞获得突变使得它们可绕过无限增殖的限制。从某些方面来看，正常细胞的有限增殖是由末端复制的端粒缩短来决定的，可被认为是肿瘤抑制的最基本的原理。但肿瘤细胞的端粒酶（Telomerase）活性使细胞保持不死。端粒酶在肿瘤发生和发展中扮演着重要角色，如何调节该酶的活性成为治疗肿瘤的一个新的探索途径。因此对端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌药物发挥作用的机制。我们观察了在原发性肝癌治疗中常用的药物对肝癌细胞端粒酶活性的影响，进一步探讨它们在肿瘤治疗中的作用机制。

　　1　材料与方法

　　1.1材料

　　人肝癌细胞SMMC-7721是由上海第二军医大学建株；RPMI-1640培养液为GIBCO产品；端粒酶活性检测使用Oncor公司的TRAP-ezeTM试剂盒，TaqDNA聚合酶、聚丙烯酰胺为Promega产品，分子量标记物为pBR322/HaeⅢ。顺铂为F.H.Faulding公司产品，阿霉素为深圳万乐制药厂产品，5-氟尿嘧啶为上海旭东海普药业公司产品，丝裂霉素为日本协和制药株式会社产品，重组人干扰素α-2b为Schering-Plough产品；全反式维甲酸（ATRA）和叠氮胸苷（AZT）为Sigma产品。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞的培养：SMMC-7721细胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。

　　1.2.2MTT法测定各药物对细胞的生长抑制率。

　　1.2.3处理细胞的药物浓度和时间：处理细胞的药物浓度为高浓度和低浓度剂量两种，低浓度参考MTT方法测定的IC₅₀浓度，高浓度为低浓度的4～15倍。顺铂为10μmol/L和150μmol/L，处理时间为高浓度4小时和去除药物再培养20小时（4＋20小时），低浓度为1、3、5天；丝裂霉素为9μmol/L和60μmol/L；阿霉素为10μmol/L和100μmol/L；5-氟尿嘧啶为1000μmol/L和4000μmol/L，处理方法同顺铂。干扰素为1000IU和5000IU，时间为3、5、9天。ATRA为10μmol/L，时间为1、3、5、7天。AZT为20μmol/L和200μmol/L，时间为1、3、7、15、21天。

　　1.2.4细胞的收集：药物处理后，0.25％胰酶消化，PBS液洗3遍，-70℃保存。

　　1.2.5端粒酶活性的测定：①细胞的裂解、端粒酶提取：收集的细胞加入200μl1×CHAPS裂解缓冲液，冰浴30min，然后15000r/min（14000g）、4℃离心30min。②蛋白定量：为使结果比较时保持在同一水平，对裂解产物利用考马斯亮蓝G-250染色法进行蛋白定量，样品在TRAP反应时总蛋白定量为0.5ng。③TRAP反应：配置好的TRAP反应样品30℃-30min孵育后，94℃－30sec，60℃－30sec扩增30循环。④反应结果利用40％非变性聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺:亚甲叉双丙烯酰胺=19∶1）电泳，结合硝酸银染色方法观察。

　　1.2.6端粒酶活性的比较：端粒酶阳性表达为从50bp开始的每隔6bp的阶梯状条带，虽然利用TRAP方法检测端粒酶活性可以进行半定量分析，但本研究因不适合统计分析，对端粒酶活性的差异的定量无法明确为具体数值，所以在本文中端粒酶活性的比较采用肉眼直接观察的方法，比较电泳条带的光密度，根据强弱的程度分为无明显变化、明显抑制和完全抑制，国外相关文献中多也是采用此种方法。

　　1.2.7流式细胞检测：收集的细胞70％酒精固定后，采用检测DNA含量的方法测定细胞周期和凋亡。

　　2　结果

　　2.1化疗药物

　　顺铂在150μmol/L处理细胞4小时时端粒酶活性无明显变化，而去除药物再培养20小时后端粒酶活性完全消失；10μmol/L随处理时间的延长，端粒酶活性逐渐降低，细胞出现G₀/G₁期阻滞（G₀/G₁比例由第1天的38.60％到第3天的53.83％和第5天的69.59％）。流式细胞术检测表明在150μmol/L处理4＋20小时端粒酶活性完全消失时，有4％凋亡出现。丝裂霉素C的结果同顺铂相似，但在本实验使用的剂量对端粒酶活性的抑制作用弱于顺铂，60μmol/L4小时无抑制，4＋20小时明显抑制，9μmol/L随处理时间的延长抑制作用逐渐增强，4＋20小时时未检测到明显凋亡（凋亡比例为0％）。而5-氟尿嘧啶和阿霉素在不同剂量和不同作用时间均无明显的抑制作用，见图1和图2。

图1　A为阳性对照;B,C,D分别为顺铂低浓度1,3,5天;E为丝裂霉素C高浓度4小时;F为丝裂霉素C高浓度4+20小时;G,H,I分别为丝裂霉C低浓度1,3,5天

图2A为阳性对照；B，C，D分别为IFN1000IU第3，5，9天；E，F，G分别为IFN5000IU第3，5，9天；H为顺铂高浓度4小时；I为顺铂高浓度4＋20小时

　　2.2干扰素

　　对端粒酶活性也有明显的抑制作用，1000IU时在第5天有明显抑制，第9天完全抑制，而5000IU在第5天就完全抑制，流式细胞术检测表明当端粒酶活性受到抑制时，细胞有明显的S期阻滞（如图1A为阳性对照；B，C，D分别为顺铂低浓度1，3，5天；E为丝裂霉素C高浓度4小时；F为丝裂霉素C高浓度4＋20小时；G，H，I分别为丝裂霉素C低浓度1，3，5天5000IU、1000IU第9天的S期比例分别为43.29％和44.03％，G2M期比例分别为8.10％和7.64％，而对照细胞的S期比例在10％～20％，G2M期比例＞30％），出现凋亡（高浓度、低浓度第5、9天的凋亡率分别为5.83％、13.70％和4.36％、10.90％），见图2。

　　2.3ATRA和AZT

　　两种药物在不同作用浓度和时间对端粒酶活性均无明显抑制作用。

　　3　讨论

　　顺铂同DNA的联结方式主要为G-Pt-G和A-Pt-G的形式，而端粒和端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTR）的碱基顺序正是富含这种结构，因此顺铂抑制了hTR的表达从而对端粒酶活性进行了调节，但有的研究说明hTR的表达和端粒酶活性的关系并无相关性^[1]，因此抑制hTR对端粒酶活性是不是有直接的影响尚不能肯定。Asai^[2]的研究表明端粒是顺铂发挥治疗作用的靶点，但缩短的端粒对端粒酶活性的调节作用如何尚不明确。丝裂霉素C可能是通过对蛋白激酶系统抑制产生作用的，蛋白激酶参与端粒酶活性的调节而且蛋白激酶C的抑制剂^[3]可对癌细胞的端粒酶活性产生明显抑制作用。2种化疗药物在抑制端粒酶活性的同时，亦诱导肿瘤细胞的凋亡，从我们的实验结果看来，端粒酶活性的下降不是凋亡的结果，因为在用高浓度顺铂或丝裂霉素C处理细胞4＋20小时后，只有少量的凋亡，而此时的端粒酶活性完全抑制。说明端粒酶活性的抑制出现在凋亡之前，可能药物对端粒酶活性的抑制和对端粒结构的破坏，启动了凋亡基因。阿霉素和5-氟尿嘧啶在不同浓度，不同时间均未对端粒酶活性产生明显影响，这和国外的一些报道是相似的。

　　干扰素可抑制某些癌基因的表达，其中包括c-myc。在端粒酶活性的控制因素中，其中端粒酶亚单位之一的hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)被认为是对端粒酶活性起着重要的调节作用^[4]，最近人hTERT的结构和hTERT基因被识别^[5]，发现在hTERT基因5-端的部分启动子编码中包含有数个c-myc蛋白联结的位点，转染表达c-myc的质粒后，hTERT的表达大大提高，而端粒酶活性也升高，说明hTERT基因是c-myc转录的目标^[6]，因此干扰素可以通过对c-myc蛋白的抑制来达到对端粒酶活性的抑制作用。hTERTmRNA也可能是干扰素作用的对象。干扰素对癌细胞的作用机制是很复杂的，细胞表面存在着干扰素的受体，干扰素通过和受体结合，对多种细胞因子产生调节作用，包括生长因子，蛋白激酶，信号传递过程等，而端粒酶的活性依赖信号传导系统和蛋白激酶的作用，因此干扰素也可能通过这些途径对端粒酶活性产生抑制效果。流式细胞术检测的结果表明，细胞在经过干扰素处理后，无论是高浓度还是低浓度，细胞周期明显阻滞在S期，说明经过干扰素作用后细胞不能进入G₂期，可能为DNA或RNA的合成受到抑制，这种抑制可能和端粒酶活性有关。

　　有研究^[7]表明ATRA10μmol/L浓度对SMMC-7721肝癌细胞有诱导分化作用，但在本文中，应用ATRA10μmol/L对肝癌细胞处理后，在各个时间阶段端粒酶活性均无明显变化。目前对ATRA诱导分化与端粒酶活性影响的研究都在恶性血液病细胞HL60或K562中进行，且多数的资料说明这些细胞在分化的同时伴有端粒酶活性的下降，但并非所有的细胞株对ATRA的分化治疗表现出端粒酶活性的抑制。AZT(3'-azido-2',3'dideoxythymidine)是在60年代合成用于爱滋病治疗的胸腺嘧啶的类似物，近年来的研究显示它可对某些化疗药如5-FU、顺铂增效，逆转癌细胞对某些化疗药的耐药，而不增加毒副作用，从而又引起了研究者的注意。AZT和DNA结合的部位包括端粒结构，可引起端粒DNA的缩短^[8]。在本文中未发现其对SMMC-7721肝癌细胞端粒酶活性有抑制作用，但国外的有些资料^[9]却证明AZT能够在乳腺癌细胞和白血病细胞中抑制端粒酶活性，其确切机制未能分析。不同药物在不同文献中的结果并不完全相同，这可能与使用了不同的细胞株有关，因为不同细胞株的特性不同，癌变的机制多种多样，因此药物在不同细胞中对细胞产生的作用也会略有差异。

　　从本研究结果来看，肝癌细胞在经过干扰素及部分化疗药的处理后，端粒酶活性下降，同时伴有细胞增殖的抑制，凋亡的产生，且端粒酶活性下降产生凋亡之前，对端粒酶活性的抑制可能是这几种药物抗癌治疗机制的一部分。端粒酶活性的表达和肿瘤的预后以及治疗效果^[10]有关，临床观察肝癌在经过治疗后端粒酶活性的变化可作为治疗效果评价的指标及判断预后的因素。

　　通讯作者：孟志强　Tel：86－21－64175590－470　E－mail:you-health@sina.com

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收稿日期：1999－08－23

　　修回日期：1999－09－24