脂质体rIL－2和肿瘤浸润淋巴细胞治疗鼠H22肝癌的体内实验研究

中国肿瘤临床 2000年第4期第27卷 实验肿瘤

作者：于静　赵治国　卢玫　段芳龄

单位：于静　河南省人民医院二内科（郑州市　450003）；赵治国　河南医科大学第二附属医院消化科；卢玫　日本中外制药北京事务所；段芳龄　河南医科大学第二附属医院消化科

关键词：脂质体rIL－2；肿瘤浸润淋巴细胞；H22肝癌

　　摘要目的：比较脂质体rIL－2和游离rIL－2分别联合肿瘤浸润淋巴细胞治疗鼠H22肝癌的效果及副作用。方法：采用薄膜分散法和超声波粉碎处理法制备脂质体rIL－2；选昆明鼠40只，随机分组进行体内治疗，游离rIL－2用量为脂质体rIL－2的3倍，观察瘤出现时间、瘤体积、瘤湿重及鼠体温的变化。结果：TIL＋rIL－2组的瘤出现时间、瘤体积、瘤湿重分别为：15±2.5d、2.44±2.97cm3、4.7±2.0g;TIL＋脂质体rIL－2组分别为：15±3.2d、2.27±2.58cm3、4.5±2.1g;二者与对照组比较均显出了肯定的治疗效果(P＜0.05)，但二者之间比较无统计学差别(P＞0.05)。TIL＋rIL－2组有明显发热反应，TIL＋脂质体rIL－2组体温正常。结论：脂质体rIL－2较游离rIL－2抗肿瘤作用提高，副作用降低。

　　Experimental Study of Treating Mice H22 Hepatoma Using Liposomal－rIL－2 and TIL

Yu Jing Zhao Zhiguo Lu Mei et al

　　(Department of Internal Medicine, Henan Provincial People′ s Hospital, Zhengzhou)

　　AbstractObjective: To compare the effect and side－effect of liposomal－rIL－2 and free rIL－2 in the treatment of mice H22 hepatoma.Methods: After preparing liposomal－rIL－2 by membrane disperse and ultrasonic crush, 40 mice with hepatoma were randomly divided into 4 groups and treated with liposomal－rIL－2＋TIL or rIL－2＋TIL and the dose of rIL－2 was three times of liposomal－rIL－2.Results: In TIL＋rIL－2 group, the tumor occuring time, tumor size and tumor weight were 15± 2.5d, 2.44± 2.97cm3 and 4.7± 2.0g respectively. In TIL＋liposomal－rIL－2 group, 15± 3.2d, 2.27 ± 2.58cm3 and 4.5± 2.1g respectively. As compared to control, the effect of both on antitumor action was positve (P＜0.05), but there was no statistical significane between these two groups (P＞0.05). The termperature of TIL＋rIL－2 group mice was higher than that of TIL＋liposomal－rIL－2 group mice (P＜0.05).Conclusion: The antitumor action of liposomal－rIL－2 is higher and the side effect is lower than those of rIL－2.

　　Key Words Liposomal－rIL－2 Tumor－infiltrating lymphocyte H22 hepatoma

　　肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在肿瘤部位产生抗肿瘤效应有赖于IL－2的存在和刺激^[1]。近年不少文献已报道了输注TIL的同时加用IL－2可明显增强TIL的抗肿瘤作用，但普遍存在一个问题，即IL－2的用量偏大，给药次数多，程度不同地出现乏力、发热等副作用，患者依从性低。我们应用脂质体包被rIL－2(Liposomal－rIL－2)，使rIL－2优先分布到肿瘤组织，延长rIL－2半衰期，起到了用量减少、副作用降低，疗效提高的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物、细胞系

　　昆明鼠，雄性，体重18～22g，本校实验动物中心提供。小鼠H22肝癌腹水瘤细胞，引自中科院上海药物所(当时由于经费少，选用了昆明鼠；另一个原因是昆明鼠尾静脉穿刺也较近交系鼠方便。当然，所得结果没有近交系鼠稳定)。

　　1.2　TIL的分离、培养见文献^[2]。

　　1.3　Liposomal－rIL－2的制备

　　按薄膜分散法首先制取复层大囊泡脂质体rIL－2，即磷脂酰胆硷(PC)和胆固醇(CH)，摩尔比为2:1，共20μmol/L，加入长颈圆底烧瓶中，加入氯仿1ml，待脂质充分溶解后，氮气吹拂去部分溶剂，然后置于旋转蒸发器上真空抽吸除去氯仿，脂质干燥成膜后，再将含rIL－210万U的1ml生理盐水加入烧瓶内，置旋涡混合器上震荡2～5小时即成；然后应用短时超声波粉碎处理即得小单室脂质体rIL－2。

　　1.4 包封率测定

　　按公式包封率^[3]测定脂质体rIL－2的包封率。

　　1.5 体内治疗试验

　　选取昆明鼠40只，随机分4组（对照组、TIL组、TIL＋Liposomal－rIL－2组、TIL＋rIL－2组），每组10只，首先每组小鼠左前肢腋窝皮下接种H22肝癌细胞0.15ml(1×10⁶个/ml),3日后开始治疗。对照组应用生理盐水静脉注射，其余3组TIL注射剂量相同，每次每只1×10⁶个，每日1次，连续7天尾静脉注射。游离rIL－2每日30万U·kg－1，分两次静脉注射，连续7天，总量210万U·kg－1。Liposomal－rIL－2每日10万U·kg－1，也分两次静脉注射，连续7天，总量70万U·kg－1，为游离rIL－2用量的1/3。

　　1.6 疗效观察

　　肿瘤出现时间，瘤体积，瘤湿重及小鼠体温。

　　统计学处理采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 Liposomal－rIL－2的形状及包封率

　　油镜观察Liposomal－rIL－2，呈大小较一致的小囊泡状结构，周边光滑，折光较强，用微形量尺测其直径，约0.03～0.06μm，平均0.04±0.03μm。rIL－2包封率14％±5.7％。

　　2.2 体内治疗结果

　　2.2.1各组瘤出现时间、瘤体积和瘤湿重　瘤出现时间指从接种肿瘤细胞当天算起，至肉眼见皮下肿瘤结节形成这一天止。3周末用游标卡尺测其肿块上、下、左、右径长，应用V=π²/6(a×b)^[4]算出瘤体积；然后处死鼠手术取下肿块，测其湿重。结果见附表。

附表　治疗后各组瘤出现时间、瘤体积和瘤湿重结果

　　注:TIL组与对照组比较P＞0.05;TIL＋rIL－2组和TIL＋Liposomal－rIL－2组与对照组比较P＜0.05;TIL＋rIL－2组与TIL＋Liposomal－rIL－2组比较P＞0.052.2.2 各组治疗中体温变化　治疗开始10日内，每日肛测体温一次。TIL＋rIL－2组出现发热，尤其在治疗后6日内明显，体温波动在39.5℃～40.3℃，与对照组比较P＜0.05，其余3组体温均正常。

　　3 讨论

　　脂质体由磷脂和附加剂（胆固醇）组成，形成具有洋葱似的封闭球形结构，含有亲水和疏水基团，故可用来包裹两亲性物质^[3]。IL－2是由T淋巴细胞等分泌的一种糖蛋白，分子量15.42kDa，可以通过IL－2受体作用，增强T细胞、巨噬细胞、NK细胞等生物学效应。外源性IL－2由静脉注入机体后，半衰期仅几分钟，迅速被肝内微粒体酶系灭活，血浆达到100pm时才能发挥抗肿瘤作用^[5]。利用脂质体包被rIL－2，通过脂质体囊泡的缓释作用，能够有效地延长其半衰期。另则，脂质体包被的药物通过非特异靶向作用聚集在肿瘤组织，发挥更大地抗肿瘤作用^[6]。我们在前期脂质体研制工作基础上^[2,7]，又联用TIL观察其抗肿瘤效应，结果显示：应用脂质体包被rIL－2和3倍剂量的游离rIL－2收到同样的地抗肿瘤效果，瘤出现时间、瘤体积和瘤湿重二者比较未见差异(P＞0.05)，但与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，通过治疗过程中体温观察，游离rIL－2组出现明显发热现象，而Liposomal－rIL－2组无此反应，说明脂质体包被rIL－2确有提高疗效，降低毒、副反应的作用。这与konno－H^[8]和谢景文等^[9]报道结果一致。

　　本文课题受河南省教委科研基金项目资助

　　参考文献

　　［1］Kradin R,Dubinett S,Mullin J, et al. Treatment of patients with advanced cancer using tumor－ infiltrating lymphocytes and interleukin－2 Transplant－proc,1988;20(2):336～ 8

　　［2］赵治国,段芳龄,于静,等.联合应用MLV－rIL－2、TIL、CY抗鼠H22肝癌的实验研究.中国肿瘤生物治疗杂志,1998;5(17):51

　　［3］陆彬.药剂学实验.北京:人民卫生出版社,1994:111

　　［4］唐西明,董郡.小鼠体内自然杀伤细胞活性与植入性B16黑色素瘤生物学行为的关系.中华病理学杂志,1993;22(5):294

　　［5］曹雪涛,叶天星,主编.白细胞介素Ⅱ的基础与临床.北京:北京科学技术出版社,1990:112～4

　　［6］Richardon DJ. Effect of liposomally trapped antitumor drugs on a drug－resistant mouse lymphoma in vivo. Br J Cancer,1982;45(4):552～6

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　　［8］Konno H,Maruo Y,Matin AF, et al. Effect of liposomol interleukin－2 on ascites－forming rat hepatoma. J Surg Oncol,1992;51(1):33～7

　　［9］谢景文,贾正平.脂质体白细胞介素Ⅱ对小鼠B16黑色素瘤肺转移及脾细胞增殖的影响.兰州医学院学报,1995;21(3):134～6