脂质体介导的鼠内皮细胞抑制素基因治疗人肝癌的研究

中国肿瘤生物治疗杂志 2000年第3期第7卷 论著

作者：汤宇澄　居中华　钱关祥　陈诗书

单位：汤宇澄　居中华　钱关祥　陈诗书（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心　上海　200025）

关键词：鼠内皮细胞抑制素；抗肿瘤作用；肝癌

　　摘　要　目的： 利用内皮细胞抑制素进行肿瘤抗血管基因治疗的尝试。方法： 用RT-PCR从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素 cDNA,经测序证实后，装入分泌表达载体pSEC-hygromycin,用 DEAE-葡聚糖将其转染COS-7细胞,从mRNA水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达,并观察分泌上清是否具有特异性抑制bFGF刺激的内皮细胞增殖作用，并通过TDT介导的dUTP缺口末端标记法和琼脂糖电泳来探讨其作用机制。在体外利用阳离子脂质体介导分泌表达载体pSEC-endo进行抗肿瘤研究。结果: 测序结果表明，克隆的鼠内皮细胞抑制素cDNA与文献报道的完全一致，RT-PCR显示转染后的COS-7细胞有内皮细胞抑制素mRNA表达，Western-blot证实转染COS-7细胞上清及包浆内均有目的蛋白表达。其分泌上清能抑制bFGF刺激的内皮细胞增殖作用,且这种作用是通过诱导细胞凋亡实现的,动物模型显示所构建分泌表达的载体能在肿瘤内表达,有效抑制荷瘤裸鼠人肝癌细胞周围的微血管形成及肿瘤的生长。结论: 这些结果为抑血管基因在肝癌基因治疗中的进一步利用打下了基础。

　　《中国图书资料分类法》分类号　R735.7-36

Liposome-Mediated Murine Endostatin Gene Therapy for Human Hepatoma

Tang Yucheng， Ju Zhonghua, Qian Guanxiang， Chen Shishu

　　(Research Center for Human Gene Therapy, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025)

　　Abstract　Objective： To demonstrate that liposome-mediated endostatin gene therapy is a viable approach for cancer antiangigensis therapy. Methods： Mouse endostatin cDNA was amplified from the murine liver by means of RT-PCR. After being verified by sequence, secreted expression vector pSEC-endo was constructed. The biological activity of the expressed endostatin was demonstrated by inhibition of proliferation of endothelial cells in response to stimulation by bFGF. The mechanism of this effect was studied by means of TDT dUTP nick-end-labeling assay and agarose electrophresis. By injection of liposomes complexed to murine endostatin cDNA, the inhibition of the growth of SMMC-7721 that implanted in nude mice was tested. Results： The sequence of mouse endostatin cDNA is identical with data reported from Olsen. The expressed endostatin could specifically inhibit the proliferation of endothelial cells in response to stimulation by basic fibroblast growth factor. The mechanism of this effect seems to be related with apoptosis. In addition, the efficacy of the endostatin vector treatment in reducing the volume of tumors implanted in nude mouse model was significant. Conclusion： These findings provide a basis for the further development of gene therapy with endostatin as an antiangiogenic gene.

　　Key words　 mouse endostatin； anti-tumor; hepatoma

　　实体瘤生长超过几个立方亳米后就需要新生血管形成以支持其继续生长^［1］，许多研究表明原发性肿瘤和转移性肿瘤生长依赖于新生血管的生成^［2～4］。endostatin是从鼠血管内皮瘤细胞株中克隆出来的血管生成抑制剂。它是胶原ⅩⅧ的羧基未端酶解产物，人鼠内皮细胞抑制素同源性很高，能特异性抑制内皮细胞增殖和新生血管生成。在荷瘤小鼠系统给予从E.coli菌珠中纯化的内皮细胞抑制素 蛋白能有效地抑制Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、B16黑色素瘤和鼠血管内皮瘤的生长，而且在这些肿瘤动物模型中末观察到有耐药性现象的发生。另外反复给予内皮细胞抑制素 能使肿瘤处于休止状态，其机制尚末阐明^［5］。

　　为解决体外重组蛋白分离纯化的复杂性及更有效地使内皮细胞抑制素在肿瘤局部达到有效作用浓度，采用RT-PCR的方法从鼠肝中克隆出了鼠内皮细胞抑制素cDNA，经测序证实后，构建能在哺乳动物细胞中分泌表达鼠内皮细胞抑制素的分泌表达载体pSEC-endo，同时在动物模型中进行了阳离子脂质体介导的分泌表达载体pSEC-endo抗肿瘤研究，为日后其在基因治疗中的应用打下了基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂

　　质粒pSEC-hygromycin购自INVOTROGEN公司。puc-T载体购自上海生工生物工程有限公司。各种限制性内切酶，T₄DNA连接酶，M-MLV逆转录酶为GIBCO BRL公司产品。QIAEXII凝胶回收试剂盒为QIAGEN公司产品。DEAE-葡聚糖试剂购自大连宝生物工程有限公司。细胞原位凋亡检测试剂盒为BOEHRINGER MANNHEIM公司产品。兔抗鼠内皮细胞抑制素多克隆抗体为德国Max-Planck Institute Rupert Timpl 教授惠赠。

　　1.2　动物及细胞株

　　COS-7细胞为本室传代保存。SMMC-7721细胞为第二军医大学提供。裸小鼠，6～8周龄，雄性，购于中科院上海实验动物中心。

　　1.3　鼠肝总RNA的提取及RT-PCR

　　按鼠的cDNA序列设计合成引物：5′端引物为5′-GGCTATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3′;3′端引物为5′-ATGAACGGACATACTCATCAGGACTTTCAGC-3′;逆转录反应按M-MLV逆转录试剂盒上方法进行。PCR反应条件参照文献［2］进行。

　　1.4　表达载体的构建

　　利用BamHⅠ，NotⅠ双酶切电泳回收550 bp的Endostatin小片段，分泌表达载体pSEC-hygromycin 经同样双酶切后，连接、转化感受态细菌DH-5α，酶切鉴定筛选获得阳性克隆。

　　1.5　COS-7细胞短暂表达endostatin

　　利用DEAE-葡聚糖转染COS-7细胞高水平、短时期表达所需蛋白质，收获上清，室温下以约1 000 g离心10 min，除去死细胞和碎片，经浓缩后，保留备用。

　　1.6　表达产物的各项性质测定

　　1.6.1　RT-PCR

　　提取转染空白载体pSEC和阳性质粒pSEC-endo的COS-7细胞总RNA，按前述方法进行RT-PCR反应。

　　1.6.2　Western blot

　　取COS-7细胞的分泌上清浓缩后，行PAGE电泳，用电转移装置将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维膜上，封闭液处理后，加入兔抗鼠多抗温育，PBS漂洗后, 加入山羊抗兔碱性磷酸酶标记的二抗，室温温育，充分洗膜后，加入BCIP/NBT显色，用含EDTA的PBS终止反应，拍照记录结果。

　　1.7　内皮细胞增殖分析

　　将牛主动脉内皮细胞消化后，用含2%新生牛血清的DMEM培养基洗2次，调整细胞计数为1×10⁵/ml，接种于96 孔培养板中，每孔50 μl，37℃培养24 h后，换用含3 ng/ml bFGF 和 浓缩后含鼠内皮细胞抑制素的分泌上清的新鲜DMEM培养基共培养24 h 后，进行MTT 比色法检测。

　　1.8　凋亡的研究

　　1.8.1　TUNEL分析

　　同上处理的牛主动脉内皮细胞用4%多聚甲醛固定液固定25 min，TUNEL分析参见宝灵曼公司产品说明进行。

　　1.8.2　琼脂糖凝胶电泳

　　收集同上处理的内皮细胞用4 ml的PBS重悬洗后，按常规制备DNA，用1.5%琼脂糖电泳观察。阳性对照组为TNF，并设不相关对照，细胞选用NIH3T3,SMMC-7721。

　　1.8.3　人肝癌动物模型

　　1．8．3．1　收集处于对数生长期的SMMC-7721，接种瘤细胞剂量为5×10⁵，隔天观察，待肿瘤结节为2～3 mm大小时，随机分为3组，每组4只动物，对照组为生理盐水组，及DOSPER介导空白质粒pSEC组，治疗组为DOSPER质粒pSEC-endo混合组，两者比例为2∶1，分别溶于HBS溶液，混合后室温下静置30 min，待DOSPER质粒混合物形成后，瘤内注射。每3 d瘤内注射1次，剂量为每次20 μg，持续12 d，并用卡尺测量1次肿瘤大小，肿瘤体积以公式1/2 ab²计算，a为长径，b为肿瘤短径，单位为毫米（mm）。

　　1．8．3．2　鼠内皮细胞抑制素瘤内蛋白表达的免疫组织化学染色，以上各组肿瘤行冰冻切片，以胞浆有棕色颗粒为阳性细胞。

　　1．8．3．3　肿瘤中微血管密度检测，同上各组肿瘤行冰冻切片后，以兔抗Von Willebrand 因子多抗为一抗，免疫组化染色后，光学显微镜下观察，任何一个棕色内皮细胞作为一个血管，每个标本选取5个视野，计算机处理系统测定单位视野（315699.8 μm²）下棕色面积，计算微血管密度（单位视野棕色面积/单位视野面积）。

　　1.9　统计学方法

　　多样本均数比较采用方差分析。

　　2　结　果

　　2.1　鼠内皮细胞抑制素的克隆及序列分析

　　提取鼠肝总RNA，RT-PCR扩增出鼠endostatin cDNA,PCR产物进行琼脂糖电泳结果显示片段大小为554 bp左右与预期大小一致，如图1所示。PCR产物经QIAEXII凝胶回收纯化片段，将endostatin cDNA克隆至puc-T载体, 测序结果表明与文献报道一致。

图1　从鼠肝脏克隆内皮细胞抑制素cDNA

　　Fig.1 RT-PCR amplication of endostatin from

　　liver of BABL/c mouse

　　1： Marker； 2： Mouse endostatin

　　2.2　构建分泌表达载体pSEC-endostatin

　　鼠endostatin是胶原ⅩⅧ羧基末端产物的酶解产物，要使克隆鼠endostatin能在基因治疗中得到应用必须要能分泌表达。因此本实验利用含小鼠IgG kappa链分泌信号的哺乳动物表达载体pSEC-hygromycin，将鼠endostatin cDNA克隆至其中，使其受载体中CMV启动子驱动，转录出带有信号肽的mRNA。酶切鉴定分析，鼠endostatin已克隆入pSEC-hygromycin 载体中(见图2)。

图2　质粒载体的酶切鉴定图

　　Fig. 2　Electrophresis pattern of pSEC-endo digested

　　by restriction enzyme

　　1： λDNA/Hind Ⅲ marker； 2： pSEC-hygromycin (digested by

　　BamHⅠ, NotⅠ)； 3： pSEC-endo (digested by BamHⅠ,NotⅠ)

　　2.3　鼠内皮细胞抑制素的表达

　　将空白质粒和阳性质粒同时转染COS-7细胞，96 h后，抽提细胞总RNA，DNaseⅠ处理后进行RT-PCR，扩增出相应大小的DNA片段，证实了内皮细胞抑制素的表达(见图3)。

图3　RT-PCR反应扩增endostatin基因片段结果

　　Fig. 3　Identification of endostatin gene by RT-PCR analysis

　　1： Marker； 2： Positive control RT-PCR

　　amplification of endostatin from liver of BABL/c mouse；

　　3： The result of RT-PCR mouse endostatin from COS-7 cells

　　transfected by pSEC-endo; 4: The result of RT-PCR of COS-7

　　cells transfected by pSEC

　　将转染阳性质粒的COS-7细胞分泌上清，细胞裂解液行SDS-PAGE电泳，转膜后行 Western blot检测，结果显示，分泌上清和细胞中均有目的蛋白表达。

　　2.4　鼠内皮细胞抑制素抑制内皮细胞增殖活性测定

　　2.4.1　分泌表达载体pSEC-endo转染COS-7或人肝癌细胞SMMC-7721后的分泌产物是否具有抑制内皮细胞增殖的活性？我们选用NIH3T3,SMMC-7721细胞和牛主动脉内皮细胞进行MTT试验，结果(阴性对照组为1.098±0.097，NIH3T3组为1.048±0.035，SMMC-7721组为1.028±0.075，牛主动脉内皮细胞组为0.528±0.090，P＜0.05)证实,浓缩后上清能有效抑制bFGF刺激的内皮细胞增殖，且这种作用是特异性针对内皮细胞的。

　　2.4.2　由于凋亡细胞核内变化最主要的是核内DNA的断裂，因此利用TUNEL分析和琼脂糖凝胶电泳我们初步探讨了鼠内皮细胞抑制素的作用机制。TUNEL分析显示，鼠内皮细胞抑制素作用的牛主动脉细胞核内有棕色颗粒存在，为阳性细胞，而NIH3T3,SMMC-7721细胞中无阳性细胞存在。DNA琼脂糖凝胶电泳中亦显示只有鼠内皮细胞抑制素作用的牛主动脉细胞组和阳性组有DNA“梯状”条带，而NIH3T3 和SMMC-7721组未见“梯状”条带(见图4)。

　　提示，鼠内皮细胞抑制素在体外能特异性诱导内皮细胞凋亡，而对其它细胞无作用，这可能是其抑制内皮细胞增殖的作用机制之一。

　　2.5　鼠内皮细胞抑制素抑制肿瘤SMMC-7721增殖作用

　　通过阳离子脂质体将表达质粒转入裸鼠皮下肿瘤内发现该治疗组肿瘤生长明显慢于非治疗组和空白治疗组（P＜0.05），显示局部利用脂质体进行原位鼠endostatin基因治疗能有效抑制肿瘤生长(见图5)。免疫组化结果显示，局部肿瘤细胞内有鼠endostatin蛋白表达。

图4　琼脂糖电泳检测endostatin诱导细胞凋亡情况

　　Fig. 4　Detection of fragmented DNA in cow artery

　　endothelial cells induced by expressed endostatin

　　1： Cow artery endothelial cells incubated with secreted supernatant from COS-7 cells transfected by pSEC-endo； 2： Cow artery endothelial cells treated with TNF； 3： NIH3T3 cells treated with secreted supernatant from COS-7 cells transfected by pSEC-endo； 4： SMMC-7721 cells treated with secreted supernatant from COS-7 cells transfected by pSEC-endo； 5： Cow artery endothelial cells treated with DMEM with 2% FCS

图5　鼠内皮细胞抑制素质粒抑制荷瘤裸鼠肝癌生长

　　Fig. 5　Inhibition of the growth of human hepatoma implanted

　　in nude mice by murine endostatin plasmid liposome complex

　　2.6　瘤内微血管密度检测结果

　　瘤内微血管密度检测显示，阳离子脂质体将表达质粒转入裸鼠皮下肿瘤组微血管密度（0.29±0.08）明显低于阴性对照组（1.18±0.16），空白对照组（1.21±0.15），三者之间有显著差异(P＜0.05)。

　　3　讨　论

　　肿瘤新生血管为肿瘤生长提供了一条转移至其它组织的途径，并为其提供生长必需的养份和氧气，近几十年来有关肿瘤新生血管的分子机制的研究发现了许多抗血管生成物质，为实体瘤的杀伤治疗提供了新思路，尤其近两年随着强有力的抑血管小肽物质angiostatin和endostatin的发现为肿瘤的抗血管治疗提供了有力的工具。其中endostatin经过动物试验己证实了具有抑制多种肿瘤生长并能诱导肿瘤处于休止期。由于现有的基因工程生产重组蛋白代价昂贵，因此我们拟用基因治疗的方法来在肿瘤局部有效表达endostatin。为此我们利用RT-PCR方法成功地从鼠肝中克隆了鼠endostatin cDNA，由于其是胶原ⅩⅧ的羧基未端酶解产物，单独endostatin 基因表达的蛋白产物是不能分泌到细胞外，故将其克隆到分泌表达载体pSEC-hygromycin 中，该载体与普通表达载体相比较具有一段小鼠IgG kappa链的分泌信号，这为日后目的蛋白的分泌表达提供了方便。实验结果表明转染分泌表达质粒的COS-7细胞能够分泌鼠endostatin，有效抑制肿瘤生长。这对于解决在原核或真核表达endostatin操作复杂，全身用药需要大剂量endostatin,代价昂贵，可能存在毒副作用的缺点提供了另一个替代办法。但脂质体-质粒混合注射法亦存在表达短暂，需要重复注射的缺点，因此将带有信号肽的endostatin cDNA克隆入腺病毒表达载体或逆转录病毒载体进行肿瘤局部高效和联合基因治疗可能是一种更好的方法。

　　本课题受国家863项目(863-Z20-01-04)

　　汤宇澄,男,28岁,博士,主要从事肿瘤基因治疗研究.

　　参 考 文 献

　　1，Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply. Sci Am， 1996， 275: 150

　　2，Dhanabal M, Ramchandran R, Volk R， et al. Endostatin: Yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma. Cancer Res, 1997, 59: 189

　　3，Chen QR, Kumar D, Stass SA， et al. Liposomes complexed to plasmids encoding angiostatin and endostatin inhibit breast cancer in nude mice. Cancer Res, 1999， 59: 3308

　　4，Dhanabal M, Ramchandran R, Waterman MJF， et al. Endostatin induce endothelial cell apoptosis. J Biol Chem， 1999， 274: 11721

　　5，Boehm T, Folkman J, Browder T， et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature， 1997, 390: 404

(1999-12-27收稿； 2000-03-09修回)