热休克蛋白70的纯化及其抗小鼠肝癌作用的研究

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 基础研究

作者：吴伟忠　刘康达　高艳琴　吴厚生　汤晓雷　汤钊猷

单位：吴伟忠（上海医科大学附属中山医院肝癌研究所，200032）；刘康达（上海医科大学附属中山医院肝癌研究所，200032）；高艳琴（上海医科大学化学教研室)；吴厚生（上海医科大学免疫教研室）；汤晓雷（上海医科大学附属中山医院肝癌研究所，200032）；汤钊猷（上海医科大学免疫教研室）

　　关键词： 肝肿瘤；癌，肝细胞；热休克蛋白70

　　【摘要】　目的　建立热休克蛋白70 (hsp70)的分离方法，观察其在小鼠体内的特异抗瘤效应。方法　用经43℃热处理12 h的H22细胞，制备裂解液，用DEAE52、ConA和ADP柱进行序贯分离，所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定。用纯化的hsp70蛋白免疫A组C3H 及C组C57BL/6小鼠, RPMI 1640 液免疫B组C3H 及D组C57BL/6小鼠。 第15天A、B组小鼠用H22攻击，C、D组小鼠用EL-4攻击，观察各组小鼠肿瘤发生率及肿瘤大小。结果　纯化蛋白经鉴定确系相对分子质量约为70 000的hsp70蛋白。A组小鼠肿瘤发生率为0/6，而B组小鼠肿瘤发生率为6/6。C组和D组小鼠的肿瘤发生率均为6/6，两组小鼠第35天的肿瘤大小差异无显著性。结论　用上述蛋白层析法可分离获得纯度高、并保留肿瘤抗原信息的hsp70蛋白。该蛋白免疫后的小鼠能抵抗同种肿瘤细胞的攻击，而对异种肿瘤细胞的抵抗能力有限。 提示纯化蛋白中的抗原信息可能不是hsp70蛋白本身，而是其所携带的小分子多肽。

Purification of hsp70 and its immunoprotective effect against mouse hepatoma

WU Weizhong, LIU Kangda, GAO Yanqin, et al.

　　（Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China）

　　【Abstract】　Objective　To purify hsp70 protein and observe its anti-tumor effect on mouse H22 hepatoma.Methods　Cytosolic hsp70 protein of heat treated H22 cells was purified successively by chromatographic procedures, including DEAE 52-cellulose, ConA-sepharose 4B and ADP-argarose chromatography. The molecular weight and the identity of the purified hsp70 protein were confirmed by SDS-PAGE and Western blot. Tumorigenicity of H22 hepatoma was examined in purified hsp70-treated C3H mice.Results　A sharp stained protein band with a molecular weight of about 70 kD was obtained and shown to be hsp70 as confirmed by Western blot. In C3H mice challenged with H22 hepatoma, tumor developed in 6 of 6 mice while in hsp70 pretreated mice, none of the 6 H22 challenged mice developed tumor. Nevertheless, C57BL/6 mice pretreated with hsp70 or RPMI 1640 all developed tumor upon challenge with EL-4 lymphoma.Conclusion　The results suggest that the immunoprotective effect of hsp70 protein is due not to hsp70 per se, but rather to the specific antigenic peptides it carries.

　　【Subject words】　Liver neoplasms;　Carcinoma, hepatocellular;　Heat shock protein70

　　hsp70蛋白的抗肿瘤作用已日益受到重视，但对其抗肿瘤机理及所携带多肽性质知之甚少。国外有学者试图从肿瘤细胞中直接纯化hsp70蛋白，以明确其所携带多肽的氨基酸结构与肿瘤特异性抗原间的关系。其中Peng等^［1］用ADP亲和层析法成功地从小鼠纤维肉瘤meth A细胞中分离获得hsp70蛋白，并证实该纯化蛋白具有肿瘤免疫原性。我们从以往的研究中发现，以热休克、丝裂霉素、β-榄香烯等因素处理H22细胞，均能使后者高表达hsp70蛋白^［2，3］，且在体内外可诱导出肿瘤杀伤性γδT细胞，激发机体产生抗同种肿瘤细胞的特异性免疫^［4，5］。为证实这些抗瘤效应是由hsp70蛋白而不是其他分子所介导的，并进而分析小鼠肝癌H22细胞来源的hsp70蛋白所携带肝癌特异抗原的结构，我们用改良的蛋白层析法，分离提纯热休克后H22细胞的hsp70蛋白，并以纯化蛋白免疫C3H、C57BL/6小鼠观察其抗肿瘤效应。

　　材料与方法

　　1.实验材料：DEAE 52-cellulose(Whatman)；CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)；Con A、ADP-Agarose及2′ 5′-ADP(Sigma)；抗鼠 hsp70 单抗 (Santa Cruz)；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体(中国科学院上海生物化学研究所)；DAB(Sigma)；硝酸纤维素薄膜(Amersham, Life Science)；蛋白分子量Marker(Promega)。

　　2.层析缓冲液：(1) 细胞裂解液(Buffer A)： 20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5内含20 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L DTT及0.5 mmol/L PMSF。(2) DEAE-52柱平衡液及洗脱液(Buffer B)：20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.6。平衡液内含20 mmol/L NaCl, 0.1 mmol/L EDTA，15 mmol/L 2-巯基乙醇(2-ME)；洗脱液内含500 mmol/L NaCl，余组份同平衡液。(3)Con A柱洗脱液(Buffer C)：50 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5，内含0.15 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L CaCl₂，15 mmol/L巯基乙醇(2-ME)。(4) ADP柱平衡液及洗脱液(Buffer D)：平衡液为20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，内含20 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl₂ ，15 mmol/L 2-ME。洗脱液内含500 mmol/L NaCl，余组份同平衡液。

　　3.实验动物：4周龄C3H、C57BL/6小鼠，雌雄各半，均购自中国科学院上海实验动物中心。

　　4.Hsp70蛋白制备：腹水来源H22细胞，共30 ml压积，经43℃休克12 h后，用10倍体积Buffer A及超声破膜，100 000 g超速离心30 min，取上清，4℃Buffer B透析过夜。

　　5.Hsp70蛋白纯化：(1)DEAE-52柱分离^［6］：上述样品10 ml加至直径1.2 cm、长20 cm的DEAE-52柱上，用Buffer B平衡液及洗脱液进行梯度洗脱，条件为每管4.8 ml/12 min，共15 h。测吸光度(曾称光密度OD)A_λ=280 nm值，收集各峰蛋白，经浓缩、透析后置4℃保存。(2)Con A柱分离^［7］：制备1根10 ml的Con A-Sepharose 4B柱（方法参见公司说明书），将DEAE-52柱分离第一峰蛋白上样至Con A柱上，用Buffer C洗脱6 h，条件为每管4.8 ml/9 min，测A值，收集蛋白，浓缩后用Buffer D透析过夜。(3) ADP柱分离^［1］：上述样品加至5 ml ADP柱上，用Buffer D平衡液先洗脱2 h，然后改用洗脱液洗脱3 h，检测A值，收集蛋白，浓缩透析后4℃保存。

　　6.蛋白分子量及性质鉴定^［8］：不同柱分离样品用5%和7.6%双层不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行蛋白分子量及纯度鉴定。ADP过柱样品电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜上。经常规漂洗、封闭后，用鼠抗鼠hsp70单抗(1∶200)为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体作为二抗，DAB进行显色，观察结果。具体方法参见《分子克隆实验指南》有关章节。

　　7.体内免疫试验：将12只C3H和12只C57BL/6小鼠均分成4组。其中A组6只C3H小鼠和C组6只C57BL/6小鼠分别用纯化的hsp70蛋白进行皮下免疫，每鼠为30 μg/100 μl，共2次，中间隔7 d。B组6只C3H小鼠和D组6只C57BL/6小鼠分别用RPMI 1640液免疫作阴性对照，途径及剂量同前。第15天时，A、B组小鼠用5×10⁴的H22细胞进行皮下攻击，而C、D组小鼠用3×10⁴的EL-4细胞（小鼠淋巴瘤细胞）进行皮下攻击。自攻击日至第35天，每隔3天观察并记录小鼠肿瘤大小及肿瘤发生率。

　　结果

　　1.DEAE-52柱层析结果：H22细胞裂解液经DEAE-52柱梯度洗脱分离后，共有4个蛋白洗脱峰（图1）。第1峰蛋白经电泳鉴定发现有多条蛋白带，在相对分子质量66 200～97 400间有3条蛋白带，其中一条分子量约为70 000左右，另两条为≥90 000的蛋白带，≤43 000处约有7条蛋白带。

图1　DEAE 52-cellulose柱层析梯度蛋白洗脱图

　　2.Con A柱层析结果：DEAE-52柱洗脱第1峰样品经Con A进一步层析分离后，可分为Con A结合及不结合两部分。其中Con A不结合蛋白经电泳鉴定，发现含目的蛋白且纯度增高。在相对分子质量70 000处有一淡染的蛋白带，而在分子量43 000处有一深染的蛋白带。

　　3.ADP柱层析结果：上述样品进一步用ADP柱进行亲和层析分离，Buffer D洗脱液中的蛋白经电泳鉴定，发现仅在相对分子质量70 000处有一染色清楚的蛋白带。至此我们得到了较纯的、分子量约为70 000的蛋白。

　　4.蛋白性质鉴定：将上述纯化所得的蛋白用特异性Western blot法鉴定，证实该蛋白确系hsp70蛋白。上述分离及鉴定结果见图2。

1：Markers；2：DEAE 52柱第1峰样品；3：Con A柱样品(不结合部分)；4：ADP柱样品(结合部分)；5：ADP柱样品(结合部分)免疫印迹结果

2　不同层析柱分离蛋白SDS-phage电泳及Western blot鉴定结果

　　5.C3H小鼠肿瘤生长情况：B组小鼠在H22肝癌细胞攻击后第9天陆续出现肿瘤生长，至攻击后第35天，肿瘤的发生率为6/6，而A组小鼠同期内肿瘤的发生率为0/6。

　　6.C57BL/6小鼠肿瘤生长情况：C组小鼠在EL-4淋巴瘤细胞攻击后第35天，肿瘤发生率为6/ 6，最早触到肿瘤时间为攻击后第16天。 而D组小鼠第13天陆续出现肿瘤生长，同期肿瘤的发生率为6/6。 至攻击后第35天，两组小鼠肿瘤大小分别为(1.29±0.28) g、(1.48±0.34) g，差异无显著性。

　　讨论

　　热休克处理的小鼠肝癌H22细胞的低渗裂解液经DEAE-52分离后，共获4个蛋白洗脱峰。该结果与Welch等^［6］的分离结果相同。其中第1峰洗脱液中富含hsp70蛋白，但尚杂有较多的相对分子质量＜60 000的其他蛋白和少量的hsp90蛋白。而第3峰洗脱液中富含hsp90蛋白及部分hsp100蛋白。利用Con A具有特异结合糖蛋白中糖基的性质，用Con A-Sepharose 4B亲和层析柱继续分离DEAE-52柱第1洗脱峰中的蛋白样品，可将其中的糖蛋白与非糖蛋白分离^［7］。电泳结果表明，经Con A柱分离后，所得的蛋白纯度有很大提高，但仍含有部分相对分子质量大约为43 000的杂蛋白。为了提高目的蛋白的纯度，我们利用ADP能与hsp70蛋白特异结合的特性，用ADP-Agarose亲和柱进一步纯化Con A柱分离所得的蛋白样品，结果获得纯度高（电泳纯）、相对分子质量为70 000的蛋白。继之，Western blot鉴定证实，经过上述一系列层析法分离纯化所得的蛋白确系hsp70蛋白，这一结果与Peng等^［1］分离结果相同。我们将一定剂量纯化的hsp70蛋白分别免疫C3H、C57BL/6小鼠，进行体内抗肿瘤效应的观察。 发现C3H细胞能抵抗同种野生型小鼠肝癌H22细胞的攻击，而对异种小鼠淋巴瘤EL-4细胞的攻击则无抵抗力。 提示经过上述分离方法纯化所得的hsp70蛋白，保留了hsp70蛋白原有的生物活性，具有肿瘤特异性的抗原信息，能激发小鼠产生特异的抗肿瘤免疫反应。国内外许多研究已证实，不同品系间小鼠的hsp70分子结构高度同源，因此我们认为，纯化hsp70蛋白的抗原信息可能不是hsp70蛋白本身，而可能是hsp70蛋白所携带的小分子多肽。这些工作证实了分离纯化的胞浆hsp70蛋白与前期我们发现的胞膜hsp70蛋白一样，同样具有肿瘤免疫原性。这为日后进一步分析肿瘤细胞来源的hsp70蛋白所携带小分子多肽的氨基酸一级结构，明确肿瘤抗原多肽的性质提供了必要的物质基础，也为将来准备开展的临床肿瘤来源的hsp70多肽复合物瘤苗的生物治疗，提供了实验和理论依据。

　　基金项目：卫生部科学研究基金资助项目(96-1-160)；上海市领先学科基金部分资助项目(93-Ⅲ-002)

　　参考文献：

　　［1］　Peng P, Menoret A, Srivastava PK. Purification of immunogenic heat shock protein 70-peptide complexes by ADP-affinity chromatography. J Immunol Methods, 1997, 204: 13-21.

　　［2］　吴伟忠，汤晓雷，刘康达，等.热休克对H22细胞膜hsp70蛋白及其mRNA水平的影响.中国肿瘤生物治疗杂志，1998，5:5-8.

　　［3］　齐永长，吴厚生，胡新美，等.β-榄香烯、丝裂霉素及热休克对H22细胞hsp70表达的影响.上海免疫学杂志，1998，18：280-282.

　　［4］　吴伟忠，汤晓雷，刘康达，等.鼠肝癌细胞的热休克蛋白诱导及其抗瘤机理研究.中华微生物学与免疫学杂志，1998，18：272-276.

　　［5］　Udono H, Srivastava PK. Heat shock protein associated peptides elicit specific cancer immunity. J Exp Med, 1993,178 :1391-1396.

　　［6］　Welch WJ, Feramisco JR. Purification of the major mammalian heat shock proteins. J Biol Chem, 1982, 257: 14949-14959.

　　［7］　黄勇，顾建新.转铁蛋白糖链结构对其受亲和性的影响.生物化学与生物物理学报，1996，28：352-357.

　　［8］　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 林枫，译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1993.852-904.

收稿日期：1999-06-16