肝癌患者外周血树突状细胞的体外扩增、鉴定及内吞能力观察

肿瘤 1999年第5期第19卷 论著

作者：刘彬彬　叶胜龙　贺平　郑宁　孙瑞霞　赵燕　汤钊猷

单位：上海医科大学中山医院　肝癌研究所(上海 200032)

关键词：肝肿瘤；树突细胞；抗原提呈；免疫治疗

　　摘要：目的　从肝癌患者外周血培养扩增树突状细胞，观察其形态、表型、内吞及递呈抗原能力，为树突状细胞在肝癌生物治疗中的应用奠定基础。方法　从肝癌患者外周血中分离单个核细胞，在GM-CSF、IL-4的诱导下培养扩增树突状细胞。光学显微镜下观察其体外培养过程中的形态特征及变化，电镜观察其超微结构，FACS观察其表型特征，MLR检测其抗原递呈能力，HRP内吞实验检测其群体内吞能力。结果　肝癌患者外周血树突状细胞具典型的形态及表型特征，较巨噬细胞更强的激发同种混合淋巴细胞反应的能力。其群体的内吞能力约在培养第5天达高峰，之后有明显下降。结论　从肝癌患者外周血中可获取较大量的、高纯度的、具较强抗原递呈能力的树突状细胞，在其具有活跃的内吞能力时，以合适的肿瘤抗原致敏可望成为肝癌生物治疗的崭新手段。

CHARACTERISTICS OF THE DENDRITIC CELLS GENERATED FROM THE PERIPHERAL BLOOD OF LIVER CANCER PATIENTS

LIU Bin-bin，YE Shen-long,HE Ping,et al.

(Liver Cancer Institute,Shanghai Medical University,Shanghai　200032,China)

　　Abstract：Objective　To culture and proliferate dendritic cells from the peripheral blood of liver cancer patients, and to observe the morphologic,phenotypic,endocytotic and antigen presenting characteristics of these cells with the purpose to lay a foundation for applying dendritic cells in the biotherapy for liver cancer.Methods　The mononuclear cells isolated from peripheral blood were cultured with the supplement of GM-CSF and IL-4 to generate dendritic cells.The morphologic characteristics of those cells were observed with light and electron microscopes and the phenotypic figures were analysed with FACS.As to the endocytosis and antigen presenting abilities of the cultured dendritic cells, the quantity of the horseradish peroxidase(HRP) uptaken in given time and the level of allogenic MLR were used as reflections respectively.Results　A large number of dendritic cells with high purity can be cultured from the peripheral blood of liver cancer patients, and those cells bear similar morphologic and phenotypic characteristics with those from healthy donors.The antigen presenting ability of those dendritic cells was more powerful than macrophages from the same patients.Furthermore,those cultured dendritic cells had active endocytotic ability and this ability peaked at the fifth day in culture but decreased sharply after then.Conclusions　These data indicate that the dendritic cells cultured from the peripheral blood of liver cancer patients may be a promising candidate to be applied in new biotherapy strategies against liver cancer.

　　Key words：　Liver neoplasas;Dendritic cells;Antigen presenting; Endocytosis;Immunotherapy

　　树突状细胞(Dendritic cells,DC)是体内专职性抗原递呈细胞之一，近年来树突状细胞在肿瘤生物治疗领域的应用备受重视。对宿主免疫应答的逃避是恶性肿瘤发生发展的重要原因之一。DC及肿瘤抗原的联合应用可望提高肿瘤的免疫原性，有效的激发抗肿瘤免疫应答，从而成为肿瘤生物治疗的又一新兴手段^［1，2］。

　　原发性肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一。近年来生物治疗在肝癌的临床治疗，尤其是复发转移的防治中，日趋发挥重要作用。但同样面临着免疫原性较弱，难以产生高效特异的免疫应答的难题。本实验建立了从肝癌患者外周血中扩增培养DC的方法，证实该来源的DC具较强的抗原递呈能力。此外因内吞能力是DC处理和递呈抗原的必要环节，本实验还建立了一种测定体外培养DC群体内吞能力的简便易行方法，检测了体外培养的人外周血DC群体内吞能力随培养天数的变化，实验结果对DC在肝癌生物治疗中具有一定的指导意义。

　　材料与方法

　　1.主要试剂

　　rhGM-CSF购自先灵宝雅公司；rhIL-4购自宝灵曼公司；淋巴细胞分离液(Ficoll,1.077 g/ml)购自上海试剂二厂；辣根过氧化酶(HRP)及其底物3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)购自上海丽珠东风生物技术有限公司；完全培养基包括：IMDM(Gibco公司)、10%的小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素。

　　2.标本

　　8例手术治疗后的原发性肝癌患者，用血细胞分离仪分离外周血单个核细胞(PBMC)，取部分用于培养树突状细胞。

　　3.外周血树突状细胞体外培养

　　约1×10⁸新鲜分离的PBMC，用无钙镁PBS(pH 7.2)洗涤3次，洗尽血小板，加入260 ml塑料培养瓶内，加15 ml完全培养基，37℃，5% CO₂温箱培养2小时。用无钙镁PBS洗去悬浮细胞，所获贴壁的单个核细胞中，加15 ml完全培养基，rhGM-CSF 100 ng/ml，rhIL-4 10 ng/ml，每3天换液一次。

　　4.树突状细胞的鉴定

　　培养5～7天的人外周血树突状细胞用如下方法初步鉴定：①扫描及透视电镜观察并摄片(由上海医科大学电镜室协助进行)。②FACS检测细胞表型(由上海第二军医大学免疫教研室协助进行)。③同种异型混合淋巴细胞反应(MLR)：外周血PBMC按上述方法取粘附细胞，在相应细胞因子诱导下培养7天后，分别收集悬浮细胞(DC)及紧密贴壁细胞(巨噬细胞)作为刺激细胞，用培养液调整细胞浓度为2×10⁶/ml，加入25 μg/ml的丝裂霉素，于37℃水浴30 min，Hanks液洗涤3次，完全培养基悬浮，分别以2×10²/孔、2×10⁴/孔及2×10⁵/孔加入96孔圆底培养板，每组设3个复孔。另取新鲜分离的同种异型外周血PBMC经PBS洗去血小板，37℃贴壁2小时后，冲洗出的非粘附细胞作为反应细胞，用培液调整细胞浓度为2×10⁶/ml，每孔加入2×10⁵，终体积为200 μl。37℃，5% CO₂培养5天后，用MTT法测定活细胞。

　　5.检测树突状细胞群体内吞能力

　　从外周血取出的贴壁细胞在相应的细胞因子的诱导下，培养第二天即出现悬浮细胞。培养2～8天，每天取约3×10⁵悬浮细胞加入1 mg/ml的HRP，37℃，5% CO₂温育30 min后，PBS洗涤2次，换离心管后再洗涤2次，细胞沉淀加含0.05% Triton X-100的10 mmol/L Tris 100 μl，裂解细胞10～15 min，再加配制好的DAB 100 μl，混匀，测定490 nm的OD值，可代表DC的群体内吞能力。

　　结果

　　一、肝癌患者外周血DC的培养生成、表面标志及形态

　　从肝癌患者外周血PBMC中获取的贴壁细胞，加入GM-CSF 100 ng/ml，IL-4 10 ng/ml培养24 h后，即见贴壁的单核细胞形成均匀散布的细胞聚体，并有少量细胞悬起，悬起的细胞仍较小，但相差显微镜下已可见到伸展的毛刺。培养3～4天，悬浮细胞明显增多，并聚集成大小不一的细胞团。培养6～7天，细胞分散，体积变大，毛刺多而密，呈现典型的DC形态(见插页第3页图1)。此时培养瓶内剩余的贴壁细胞为巨噬细胞。每1×10⁸ PBMC中可培养获得3～8×10⁷ DC，不同患者的DC扩增能力有一定差异。

图1　肝癌患者外周血DC体外培养不同时期的形态

　　A：培养第4天，细胞聚集成团。B：培养第7天，细胞表面树突明显。

　　培养第5天的悬浮细胞进行电镜观察，扫描电镜示细胞表面大量的皱壁和树状突起。透视电镜下亦可见DC伸展的大量树突，胞浆内富含线粒体，较少溶酶体(见插页第3页图2)。

图2　DC的超微结构

　　A：扫描电镜　细胞表面有大量皱壁及突变起。(×2000)

　　B：透射电镜　核偏位，细胞突起明显，胞内大量线粒体，较少溶酶体。(×5000)

　　培养第7天的悬浮细胞用FACS分析其表型特性，90%以上的细胞高表达HLA-DR及共刺激分子B7-2。部分细胞表达郎罕氏细胞特异性标志CD1a，而单核细胞特异性标志CD14几无表达(见图1)。

图1　培养第7天DC表面表型检测

A.对照

　　B.大部分(76%)细胞表达B7-2，部分细胞(10%)亦表达CD1a

　　C.90%细胞表达HLA-DR

　　D.不表达单核细胞标志CD14

　　二、DC激发同种异型混合淋巴细胞反应的能力

　　从肝癌患者外周血中制备的DC具较巨噬细胞更强的激发MLR的能力(见图2)。表明DC具较强的抗原递呈及免疫刺激的活性。

图2　DC及MΦ激发同种混合淋巴细胞反应的能力

　　三、DC的群体内吞能力观察

　　以HRP的内吞量反映的DC的群体内吞能力随培养天数的不同(成熟程度的不同)而变化，培养第5天达高峰，其后有明显下降(见图3)。

图3　不同培养天数DC内吞能力的变化

　　讨论

　　树突状细胞是已知体内功能最强的专职抗原递呈细胞，并被认为是体内唯一能活化静息T细胞(resting T cells,naive T cells)的抗原递呈细胞，因此在正常免疫应答，尤其是初级免疫应答的产生中，起着不可缺少的重要作用。DC在体内分布广泛但数量很少。近年来随着DC体外扩增培养方法的建立，它在感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤的防治及移植排斥反应的控制等许多领域的应用正日趋受到重视，特别它在增强机体特异性抗肿瘤免疫能力中的作用，使其成为肿瘤生物治疗的又一崭新手段。动物实验表明，用肿瘤抗原肽，肿瘤细胞RNA等体外冲击致敏DC后回输体内，可诱导机体产生较强的抗肿瘤免疫，甚至可以治疗已建立的低免疫原性肿瘤。在国外，DC作为新的肿瘤治疗手段已进入临床试验阶段^［3～8］。

　　原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶性疾病之一，占城乡恶性肿瘤死亡率的第2位。近几十年来，随着诊疗手段的进步，肝癌的预后有了很大的改善，但手术切除率低，术后复发转移率高，化疗效果不理想等，仍是改善预后的主要障碍。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一，尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。围绕DC建立的一些肿瘤生物治疗手段，无疑也将为原发性肝癌这种低免疫原性肿瘤的治疗带来新的希望。故作者在本实验中建立了从肝癌患者外周血中扩增培养DC的方法，并对其形态及功能作了初步观察。

　　DC的一些形态及功能特征在其递呈抗原、活化T细胞的过程中发挥重要作用。如其表面高表达MHC分子、共刺激分子和粘附分子，可保证和促进T细胞的有效激活^［3］。本实验获取的细胞具典型的DC形态特征，高表达HLA-DR、B7-2，部分表达郎罕氏细胞特征性标志CD1a，不表达单核细胞特征性标志CD14，并有较强的刺激同种异型MLR的能力。表明本实验获取的细胞是典型的树突状细胞，抗原递呈能力强，具备活化机体免疫应答的能力，将在肝癌的生物治疗中得到较好的应用。内吞能力是DC处理和递呈抗原的首要环节。一般来讲，未成熟状态的DC具活跃的内吞能力，尤其以DC特征性的巨吞饮(macropinocytosis)形式摄入大量可溶性抗原物质。随着DC的逐步成熟，其细胞骨架结构发生改变，内吞能力减弱，迁移能力增强，粘附分子及共刺激分子的表达上调^［9，10］。本实验建立了一种简便易行的测定DC群体内吞能力的方法，发现体外培养DC的内吞能力在培养第5天达高峰，其后明显下降，为确定抗原致敏DC的最佳时机提供了理论依据。此外，在培养过程中还发现，来自不同患者的DC体外扩增能力有一定的差异，这种差异是否与患者的预后有关，是否某些患者体内存在抑制DC增殖的因素均值得进一步的探讨。

　　总之，本实验从肝癌患者外周血中扩增培养获取了较大量的DC，并对其形态及功能进行了初步观察。实验结果为DC的进一步研究及其在原发性肝癌生物治疗中的临床应用打下了基础。

　　作者简介：刘彬彬，女，博士研究生，助理研究员。

　　基金项目：本课题由国家自然科学基金(39770826)资助

　　参考文献

　　［1］Girolomoni G,Ricciardi-Castagnoli P.Dendritic cells hold promise for immunotherapy.Immunol Today,1997,18:102

　　［2］Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol,1991,9:271

　　［3］Hart DNJ.Dendritic cells:unique leukocyte populations which control the primary immune response.Blood,1997,90:324

　　［4］Takamizawa M,Rivas A,Fagnoni F, et al. Dendritic cells that process and present nominal antigens to naive T lymphocytes are derived from CD⁺₂ precursors. J Immunol,1997,158:2134

　　［5］Young JW,Inaba K.Dendritic cells as adjuvants for class I major histocompatibility complex-restricted antitumor immunity. J Exp Med,1996,183:7

　　［6］Karhumaki E,Viljanen ME,Cottler M, et al. An improved enrichment method for functionally competent,highly purified peripheral blood dendritic cells and its application to HIV-infected blood samples. Clin Exp Immunol,1993,91:482

　　［7］Steinman RM.Dendritic cells and immune-based therapies.Exp Hematol,1996,24:859

　　［8］Mukherji B,Chakraborty NG,Yamasaki S, et al. Induction of antigen specific cytolytic T cells in situ in human melanoma by immunization with synthetic peptide-pulsed autologous antigen presentation cells.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:8078

　　［9］Winzler C,Rovere P,Rescigno M, et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med,1997,185:317

　　［10］Sallusto F,Cella M,Danieli C, et al. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate marcromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment:downregulation by cytokines and bacterial products.J Exp Med,1995,182:389

(收稿日期：1998-11-26)