榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca-F25/CL-16A3的抗肿瘤作用及对细胞周期的影响

中药药理与临床 1999年第5期第15卷 实验研究

作者：左云飞　张耀铮　魏　巍　郑　军　张　红

单位：左云飞　张耀铮　魏　巍　郑　军　大连医科大学检验系临床生化教研室　大连　116027；张　红　大连医科大学附属二院中医科　大连　116023

　　关键词： 榄香烯；凋亡；流式细胞术

　　提　要　榄香烯可明显抑制Hca-F₂₅/CL-16A₃细胞的增殖，杀伤肿瘤细胞，榄香烯对G₀／G₁期细胞无明显作用，主要作用于S期，阻止由S期进入G₂／M期，从而抑制肿瘤生长；可在G₀／G₁期前出现一个凋亡特异的AP峰。

　　榄香烯(Elemene)是榄香烯类的混合物，主要成分为β-榄香烯，另含少许的δ-榄香烯和γ-榄香烯，药理与临床试验已证明它对肿瘤有确切疗效。本文通过对Hca-F₂₅/CL-16A₃瘤细胞DNA含量分析、诱导细胞凋亡作用及对细胞团的分析来探讨它的抗肿瘤作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　试验药物　榄香烯为大连市医药科学研究所产品，浓度1%，批准文号93卫药证字X-208号。

　　1.2　动物及瘤株　Bal B/C近交纯系小鼠由本校病理教研室提供。Hca-F₂₅/CL-16A₃腹水型肝癌细胞株由本校病理教研室提供。

　　1.3　实验方法　常法接种Hca-F₂₅/CL-16A₃细胞5×10⁶个／ml于小鼠腹腔，7天后取腹水加入RPMI 1640洗涤3遍，稀释至瘤细胞和RPMI 1640共10ml(浓度为4.6×10⁷个／ml)加入1%的榄香烯0.2ml(浓度为2μg／ml)，分别于CO₂环境培养15′、30′、60′、90′、120′后计算肿瘤细胞杀伤率。0.5μg／ml、1μg／ml、2μg／ml、3μg／ml作用60′后计算杀伤率。培养细胞经200g离心10′后，用PI染色30′分钟后。用流式细胞仪分析DNA倍体。

　　2　实验结果

　　2.1　榄香烯对Hca-F₂₅/CL-16A₃瘤细胞的体外抗肿瘤作用　榄香烯与肿瘤细胞作用15′、30′、60′、90′、120′的杀伤率分别为38%、39.1%、78.3%、95.7%、100%，四种浓度的杀伤率分别为19.6%、43.5%、73.9%、100%。

　　2.2　榄香烯对Hca-F₂₅/CL-16A₃细胞周期的影响　见图1。

图1　榄香烯作用于Hca-F₂₅/CL-16A₃的光散射图

　　a：对照组　b：榄香烯作用30分钟

　　c：榄香烯作用60分钟　d：榄香烯作用120分钟

　　由图1可以看出，在整个作用过程中通过的榄香烯作用一个细胞群转变为两个细胞群大细胞群和小细胞群。

　　分别对大小细胞群进行细胞群细胞周期的分析(图略)结果显示，小细胞群在横坐标30～50处呈单纯的一个峰，细胞均一，形态较小，峰位于G₀／G₁期的细胞对榄香烯的敏感性较差，提示可能榄香烯对于G₁／G₀期细胞作用较弱。大细胞群细胞偏大，形态较为均一，对榄香烯的反应敏感，细胞分期较为明显，且榄香烯的抑制作用明显发生于这一细胞群中。在榄香烯作用早期(60′内)S期随着作用时间的延长有增加的趋势，30′时达到峰值，而随着作用时间的进一步延长，又慢慢减低，而在整个过程中，G₂／M期均处于一个较低的水平，可能是榄香烯作用于S期而抑制其向G₁／M期的过渡。

　　2.3　榄香烯对Hca-F₂₅/CL-16A₃的DNA含量的影响　DNA含量图(FL₂-A／FL₂-W）检测表明，当药物作用到30′时，DNA的含量明显增加，60′以后DNA含量又慢慢减少，到120′时DNA到达最小，与直方图结果相符，说明此时可能大部分细胞存在于S期。

图2　榄香烯作用于Hca-F₂₅/CL-16A₃形成的三维图谱

　　a：对照　b：榄香烯作用15分钟　c：榄香烯作用30分钟

　　d：榄香烯作用60分钟　e：榄香烯作用120分钟

　　2.4　榄香烯对小鼠Hca-F₂₅/CL-16A₃瘤细胞的诱导凋亡作用　榄香烯作用60′前未见到有凋亡峰出现，但在60′以后可以见到在G₀／G₁期之前出现一个峰，在120′时达到最大，这标志着凋亡细胞的产生，并随着时间的延长，榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡作用增强。

　　3　讨论

　　榄香烯具有广谱的抗肿瘤作用，毒副作用小，对肝肾功能无损害，无骨髓抑制作用^［1］。榄香烯对肿瘤的抑制作用主要通过作用细胞周期的直接杀伤作用和诱导肿瘤细胞凋亡。

　　本实验通过对细胞群的分析，确定为一个细胞系，两团细胞为处于不同细胞周期的细胞，由于G₀／G₁期的DNA为单倍体，故细胞较小，DNA含量较少，成为图中的小细胞群；而处于S期的细胞由于其DNA的不断合成，故其胞体较大，DNA的含量也较多。胞体大小的不同及DNA含量的不同导致了在光散射图上形成两个细胞群。通过对这两个细胞群的分析，可能榄香烯对肿瘤细胞的作用发生于S期，细胞可以正常通过G1期进入S期，而在DNA合成旺盛的S期发生阻滞，不能正常的进入G₂／M期而完成细胞分裂周期，即发生S期的积蓄，导致细胞的死亡。本实验结果还表明在榄香烯作用早期主要反映在细胞周期上发生了S期的积蓄。本实验结果表明：在发生S期积蓄的这一段时间(60′内)内肿瘤细胞的杀伤率达78.3%，而从细胞凋亡开始，细胞的杀伤率仅有22.7%，因此推测，可能在整个杀伤肿瘤细胞的过程中，以作用S期的直接杀伤作用为主，先杀伤，后诱导。

　　参考文献

　　1　杨　晔，王仙平，郁琳琳，等.榄香烯抗癌作用与诱导肿瘤细胞凋亡.中华肿瘤杂志，1996；68(3)∶169