半乳糖抗小鼠CD₃单抗作为肝癌术后免疫治疗载体的研究

中华核医学杂志 2000年第5期第20卷 论著

作者：李云春　管昌田　杨晓川　何生　蒋平　袁霖

单位：李云春（610041　成都,华西医科大学附属第一医院核医学科）；管昌田（610041　成都,华西医科大学附属第一医院核医学科）；杨晓川（610041　成都,华西医科大学附属第一医院核医学科）　何生（普外科）　蒋平（普外科）　袁霖（普外科）

　　关键词： 肝肿瘤；癌；放射免疫疗法；抗体，单克隆； 动物，实验

　　【摘要】　目的　探讨利用放射性核素示踪技术研究半乳糖抗小鼠CD₃单克隆抗体(Gal-Ant-CD₃ McAb)作为原发性肝癌(PLC)术后免疫治疗载体的可行性。方法　以半乳糖(Gal)为原料,制得2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IME),与抗小鼠CD₃单克隆抗体(Ant-CD₃ McAb)共价偶联制得Gal-Ant-CD₃ McAb,再用¹³¹I或¹²⁵I标记Gal-Ant-CD₃ McAb和Ant-CD₃ McAb,通过小鼠体内分布实验和家兔显像实验,对比研究两者肝化差异;将Gal-Ant-CD₃ McAb与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)联接制得Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL,研究其体外趋肝性和杀伤自体肿瘤细胞作用。结果　Gal-Ant-CD₃ McAb具有明显的趋肝性,每克肝组织最大摄取率为注入量的(59.0±2.1)%,是Ant-CD₃ McAb的2倍以上;Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL在体外有良好的趋肝性,且杀伤自体肿瘤细胞的作用极强。结论　Gal-Ant-CD₃ McAb有可能作为PLC术后免疫治疗的载体。

The feasibility research of galactosyl-anti-mouse CD₃ monoclonal antibody being used as carrier of immunotherapy after surgical operation of liver cancer

LI Yunchun　GUAN Changtian　YANG Xiaochuan

　　（Department of Nuclear Medicine, The First University Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China）

　　【Abstract】　Objective　To probe into the feasibility of galactosyl-anti-mouse CD₃ monoclonal antibody (Gal-Ant-CD₃ McAb) being used as carrier of immunotherapy after surgical operation of liver cancer. Methods　Gal-Ant-CD₃ McAb was prepared by the covalent coupling of anti-mouse CD₃ monoclonal antibody (Ant-CD₃ McAb) with a bifunctional reagent, 2-imino-2-methoxyethyl-1-thiogalactose. After Gal-Ant-CD₃ McAb and Ant-CD₃ McAb were labelled with ¹³¹　I or ¹²⁵　I, the data of biodistribution in mice, and of imaging in rabbit were obtained. After tumour infiltrating lymphocytes (TIL) and Gal-Ant-CD₃ McAb were coupled into Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL, its livertaxis and cytotoxic activity against autologous cancer cells were measured in vitro. Results　Gal-Ant-CD₃ McAb had remarkable livertaxis and its uptake in per gram liver was (59.0±2.1)% that was more than two-fold higher than that of Ant-CD₃ McAb. Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL had an obvious livertaxis and cytotoxic activity against autologous cancer cells in vitro. Conclusion　Gal-Ant-CD₃ McAb can be used as the carrier of immunotherapy after surgical operation of liver cancer.

　　【Key words】　Liver neoplasms; Carcinoma; Radioimmunotherapy; Antibodies, monoclonal;Animals, laboratory

　　原发性肝癌(PLC)手术后的复发率高达60%～80%,而肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在防治肝癌术后复发中具有独特的作用^［1,2］。但人体内其他组织(如肺)亦可与TIL发生免疫反应而结合TIL,降低其防治肝癌术后复发的作用。若行肝动脉或门静脉插管输注TIL,既繁琐又给患者造成更多的痛苦。利用哺乳动物肝细胞膜上的无唾液酸糖蛋白受体特异性结合分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白的特性,将半乳糖(Gal)与抗小鼠CD₃单克隆抗体(Ant-CD₃ McAb)偶联,制得的Gal-Ant-CD₃ McAb可望将TIL定向载带到肝脏,实现静脉给药后肝癌术后的免疫防治。本研究利用放射性核素示踪技术研究Gal-Ant-CD₃ McAb的趋肝性,及其联接TIL后的体外趋肝性和杀伤自体肿瘤细胞的作用,以探讨其作为肝癌术后免疫治疗载体的可行性。

　　材料和方法

　　一、Gal-Ant-CD₃ McAb趋肝性的研究

　　1. Gal-Ant-CD₃ McAb的合成。参照文献［3］方法进行,以Gal为原料,先合成双功能试剂IME-硫代半乳糖苷,再在缓冲液中与Ant-CD₃ McAb偶联,得Gal-Ant-CD₃ McAb。采用苯酚-硫酸法测出Gal-Ant-CD₃ McAb的糖密度为60.15。

　　2. Gal-Ant-CD₃ McAb和Ant-CD₃ McAb的¹³¹I或¹²⁵I标记。参照文献［3］方法进行,即在2种化合物中放射性碘均直接标记在McAb分子的侧链上。标记后经Sephadex G25柱纯化,再用三氯醋酸沉淀法检测,其放化纯度均大于98%。

　　3. 小鼠体内分布实验。30只体重为10～15 g的昆明小鼠尾静脉注射¹²⁵I-Gal-Ant-CD₃ McAb 0.2 mL(约含化学量0.5 μg,0.074 MBq),随机分为5组,分别在注药后5、15、30、60、120 min断头处死,取各脏器测定放射性计数。结果以%ID/g表示。用同样的方法进行¹²⁵I-Ant-CD₃ McAb小鼠体内分布实验。并对2种药物在各脏器的分布进行t检验,以观察其分布差异。

　　4. 家兔显像。取家兔1只,体重2～2.5 kg,静脉注射¹³¹I-Gal-Ant-CD₃ McAb约18 MBq,化学量约5 μg。注射后立即用Siemens SPECT仪,按1帧/min连续采集120帧。分别选择全身、肝、心、肺、肾为感兴趣区(ROI),得出肝、心、肺、肾时间-放射性曲线。并拍摄注药后5、15、30、60、90、120 min时的显像图。用相同方法进行¹³¹I-Ant-CD₃ McAb家兔显像。

　　二、Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL的体外趋肝性研究

　　1. Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL的制备。取2.0×10⁶个TIL培养4周,加入Gal-Ant-CD₃ McAb 12.0 μg,在RPMI 1640培养液中置于37 ℃体积分数5%(下同)CO₂孵箱共同培养2 h。在流式细胞仪上测定Gal-Ant-CD₃ McAb与TIL的结合率为97.9%。

　　2. Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL的体外趋肝性观察。取Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL和肝细胞,分别用RPMI 1640液调制成1.0×10⁶/mL和1.0×10⁴/mL,各取4 mL加入同一曲颈细胞培养瓶中。置37 ℃ 5% CO₂孵箱共同培养,在培养5、15、120 min时均在倒置相差显微镜下随机观察10个视野,测算两者的粘附情况。用同样的方法观察TIL与肝细胞的粘附情况。

　　三、Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL体外杀伤自体肿瘤细胞作用的研究

　　1. 透射电镜观察。取RPMI 1640培养液配制的H₂₂小鼠肝癌细胞株(1.0×10⁵/mL)和Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL(2.0×10⁶/mL)各0.5 mL,分别加入4支塑料离心管中,置于37 ℃ 5% CO₂孵箱培养,分别在培养0.5、1、3 h加入体积分数3%戊二醛固定液固定,0.1 mol/L PBS冲洗,然后用体积分数1% OsO₄固定2 h,丙酮逐级脱水,Epon812包埋,作50～60 nm超薄切片,用醋酸铀及柠檬酸铅双重染色,H-600IV透射电子显微镜观察。

　　2. 杀伤活性测定。取96孔平底细胞培养板,每孔加2.0×10⁶/mL Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL和质量分数5%(下同)FCS-RPMI-1640培养液配制的1.0×10⁵/mL对数生长期H₂₂小鼠肝癌细胞各100 μL,每组设10个复孔,为实验组。以每孔加入Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL和5% FCS-RPMI 1640培养液各100 μL(设5个复孔)为效应细胞对照组。以每孔加入5% FCS-RPMI 1640培养液配制的1.0×10⁵/mL对数生长期H₂₂小鼠肝癌细胞和5% FCS-RPMI 1640培养液各100 μL(设5个复孔)为靶细胞对照组。将上述3组一同在5% CO₂ 37 ℃下培养20 h,1 500 r/min离心,弃上清液110 μL,加入MTT 10 μL/well继续培养6 h,加质量分数20%SDS和50%DMF溶解液100 μL,3 h后测A_570nm和A_630nm值,每孔A值=A_570nm-A_630nm。杀伤活性%=［1-(实验组-效应细胞对照)/靶细胞对照］×100。用同样方法测定TIL的杀伤活性。

　　结果

　　一、Gal-Ant-CD₃ McAb的趋肝性

　　1. 小鼠体内分布。Gal-Ant-CD₃ McAb和Ant-CD₃ McAb的肝摄取均在注药后5 min最高,为59.0%ID/g和28.8%ID/g,前者为后者的2倍;均随时间延长肝内摄取率逐渐降低。在观察期内,各时相前者的肝摄取率均为同时刻后者的2～3倍。在观察期内,Gal-Ant-CD₃ McAb的肺摄取远小于Ant-CD₃ McAb,在注药后5 min时分别为31%ID/g和44.5%ID/g,前者为后者的70%,且前者清除快,而后者无明显清除迹象,60 min时前者仅为后者的30%。总之,Gal-Ant-CD₃ McAb具有肝靶向药物的药代动力学特点,而Ant-CD₃ McAb无此特点。两药物在肺、肝、肾的分布差异有高度显著性(肺:t=6.926;肝:t=17.225;肾:t=12.518,P均＜0.01)。

　　2. 家兔显像。由¹³¹I-Gal-Ant-CD₃ McAb家兔显像(图1)可见,注射示踪剂后5 min,肝脏影像清晰,直到60 min时示踪剂在肝脏的浓聚均未明显减少,但90、120 min时肝脏影像逐渐减弱;30～120 min时肠道放射性逐渐增强;5～120 min内均未见明显的肺和肾脏显影。家兔主要脏器时间-放射性曲线(图2)可见,¹³¹I-Gal-Ant-CD₃ McAb的肝分布始终远远大于其他脏器,示明显的体内趋肝性。而¹³¹I-Ant-CD₃McAb家兔显像示,在5～120 min内肺显影显著,肝影模糊。上述结果进一步验证了小鼠分布实验结果。

图1　¹³¹I-Ant-CD₃McAb家兔显像图

图2　¹³¹I-Gal-Ant-CD₃ McAb家兔各脏器时间-放射性曲线

　　二、Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL的体外趋肝性

　　Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL与肝细胞共同培养5 min,有少量Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL与肝细胞粘附,约占所测视野的20%;15 min时,Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL呈“花环状”紧贴排列在同一个肝细胞周围,并有大量Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL围绕肝细胞相互粘附成团如“桑椹状”,约占所测视野的70%;2 h时整个培养瓶内Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL与肝细胞粘附现象明显减少,约占所测视野的30%。而TIL与肝细胞共同培养5、15、120 min均呈游离状态,未见其相互粘附。

　　三、Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL体外杀伤自体肿瘤细胞的作用

　　1. 透射电镜观察如图3。Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL与H₂₂小鼠肝癌细胞共同培养0.5 h,TIL伸出伪足与靶细胞膜接触,接触处及靶细胞膜其他部分均有中断、不连续,靶细胞核膜消失,核变性凝聚,内质网扩张、线粒体肿胀,线粒体嵴尚隐约可见,基质透明(图3a);部分靶细胞核染色质聚集成致密大小不等的团块状物,贴附于核膜内沿,即染色质边缘化(图3b)。共同培养1 h,TIL伪足伸入破碎靶细胞浆内,靶细胞膜完全消失,细胞内结构扩散,但仍可见扩张内质网和肿胀线粒体(图3c)。3 h靶细胞严重破坏,细胞内结构变性凝集,核消失,呈大空腔状,而TIL结构完整无损(图3d)。

图3　Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL体外杀伤自体肿瘤细胞的作用　×10⁵

　　2. 杀伤活性。Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL和TIL杀伤自体肿瘤细胞 (小鼠H₂₂肝癌细胞) 活性分别为36.7%和31.3%。

　　讨论

　　TIL能特异性杀伤残留癌细胞,消灭微小转移灶,明显降低PLC的术后复发率,延长生存期^［1,2］,但其疗法费力、昂贵,限制了其临床应用。仅存在于哺乳动物肝细胞膜上的无唾液酸糖蛋白受体能特异性识别分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白^［3-6］,因此,以后者为载体可望将TIL定向载带到肝脏,经受体介导进入肝细胞内发挥药理作用。由于Ant-CD₃ McAb能激活TIL,因此我们将Ant-CD₃ McAb与Gal偶联,制备Gal-Ant-CD₃ McAb,拟作为TIL免疫防治肝癌术后复发的载体。

　　本研究结果表明:①Gal-Ant-CD₃ McAb有显著的趋肝性,有效地改善了Ant-CD₃ McAb的体内分布,肝脏每克组织的摄取高达(59.0±2.1)%;②Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL有良好的体外趋肝性;③Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL有极强的杀伤自体肿瘤细胞作用,且Gal与Ant-CD₃ McAb偶联后,不影响Ant-CD₃ McAb对TIL的激活及激活后的TIL对自体肿瘤细胞的杀伤作用。研究还表明,Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL在体内也有趋肝性(另文报告)。因此,Gal-Ant-CD₃ McAb有可能作为PLC术后TIL免疫治疗的载体。

　　Ant-CD₃ McAb在肺的浓聚高于其他脏器,可能为肺组织有较高密度的T淋巴细胞,其表面CD₃分子与Ant-CD₃ McAb发生抗原抗体结合而滞留。但Gal-Ant-CD₃ McAb 60.15的糖密度使无唾液酸糖蛋白受体有效地争夺了Ant-CD₃ McAb在肺的滞留,呈显著的趋肝性。Gal-Ant-CD₃ McAb-TIL与肝细胞共同培养,最初两者有明显粘附,但2 h时两者粘附反而减少,可能是Gal-Ant-CD₃ McAb与无唾液酸糖蛋白受体结合后内化,使TIL失去了与肝细胞结合的桥梁,从而使TIL与肝细胞粘附解离,这对TIL到达肝内后执行其杀伤肿瘤细胞功能有重要意义。

　　四川省科委科研基金资助项目

　　参　考　文　献

　　1，王一, 陈汉, 郑孟超, 等. 肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的研究与应用. 中华外科杂志, 1995, 33:29-31.

　　2，张一心, 尤其悒, 汪晓莹, 等. 肿瘤浸润淋巴细胞在肝癌患者的术后应用. 中华医学杂志, 1997, 77:867-868.

　　3，李云春, 管昌田, 杨晓川, 等. 半乳糖基人生长激素的肝靶向机理研究. 中华核医学杂志, 1997, 17:106-108.

　　4，管昌田, 钟裕国, 梁正路, 等. 半乳糖基干扰素的合成及其肝靶向性研究. 中华核医学杂志, 1996, 16:58-59.

　　5，庞其捷, 贺于玲, 李铜铃, 等. 肝靶向抗疟药NGA-PQ的合成及其抗疟作用. 中国药物化学杂志, 1994, 4:240-244.

　　6，管昌田, 李林, 李云春, 等. 抗癌药NGA-DHAQ的趋肝性及其机理研究. 同位素, 1998, 11:13-17.

(收稿日期:1999-10-24)