原发性胃癌的比较基因组杂交研究

中华医学遗传学杂志 1999年第6期第16卷 论著

作者：傅松滨　王柏秋　关新元　夏建川　吕嵩　张贵寅　李璞

单位：傅松滨、王柏秋、夏建川、吕嵩、张贵寅、李璞　150086哈尔滨，哈尔滨医科大学医学遗传学研究室；关新元　美国NIH国家人类基因组研究中心

关键词：胃癌；比较基因组杂交；基因克隆

　　【摘要】　目的　研究胃癌发生和发展过程中是否涉及其它未知的癌基因和抑癌基因。方法　采用比较基因组杂交法(comparative genomic hybridization，CGH)分析了43例原发性胃癌。结果　3p(8/43)、8q(8/43)、20号染色体［20(9/43),20p(7/43)、20q(4/43)］、12q(16/43)、13q(12/43)的扩增，19号染色体［19(15/43),19p(13/43)］、17号染色体［17(8/43),17p(10/43)］、16号染色体(10/43)和1p(11/43)区域的缺失为胃癌的特征性变化。结论　提示3p、8q、12q、13q、20号染色体、17号染色体、16号染色体和1p区域可能存在一些与胃癌形成相关的未知基因。

Comparative genomic hybridization analysis of primary gastric carcinomas

FU Songbin^*，WANG Baiqiu, GUAN Xinyuan, XIA Jianchuan, LU Song, ZHANG Guiyin, LI Pu.* Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin 150086, P.R.China E-mail:Fusb@ems.hrbmu.edu.cn

　　【Abstract】　Objective　To investigate whether unknown genes are involved in the tumorigenesis of gastric cancer.Methods　Forty-three primary gastric carcinomas were analyzed by comparative genomic hybridization (CGH).Results　A gain in chromosomes 3p(8/43), 8q(8/43), 20［20(9/43), 20p(7/43),20q(4/43)］,12q(16/43),and 13q(12/43) was observed while a loss of 19［19(15/43),19p(13/43),17［17(8/43),17p(10/43)］,16(10/43) and 1p(11/43) was discovered.Conclusion　There were characteristic changes in 3p, 8q, 20,12q, 13q, 19,17,16,and 1p in gastric carcinoma, and some unknown genes located in the above regions might be of importance to gastric carcinoma pathogenesis.

　　【Key words】　Gastric cancer　　Comparative genomic hybridization　　Gene cloning

　　人类肿瘤的发生是一个包含多重遗传变化的多步骤过程，其中一项重要的遗传变化是肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活^［1］。目前，应用先进的分子细胞遗传学技术寻找肿瘤中相关的抑癌基因，并研究这些基因在肿瘤形成过程中的变化，是当前人类恶性肿瘤研究的重要领域，对揭示肿瘤发生发展机理具有重要的意义。胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤。1997年，我国恶性肿瘤死因中，胃癌占第1位。我们采用最新发展起来的比较基因组杂交^［2］(comparative genomic hybridization,CGH)等分子生物学技术，分析了43例人类原发性胃癌的DNA样品，所获结果为克隆人体胃癌发生相关基因提供了重要依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　43例原发性胃癌来自哈尔滨医科大学第1、第2、第3附属医院，取材前患者均未接受放射治疗和化学治疗。病理诊断为低分化性腺癌19例，中低分化性腺癌14例，中分化性腺癌10例。其中10例伴淋巴结转移。

　　1.2　方法

　　1.2.1　染色体标本的制备　常规方法制备染色体标本，自然干燥，-20℃保存。

　　1.2.2　DNA探针制备　DNA探针用切口平移法标记。肿瘤DNA用biotin-16-dUTP标记：正常参照DNA用digoxigenin-11-dUTP标记。通过调整DNase与DNA聚合酶Ⅰ的量，使得探针片段长度为600～2 000bp(500～1 000bp)，以产生均匀一致的、强烈的杂交信号。标记后的DNA经两次乙醇沉淀纯化。

　　1.2.3　原发瘤DNA的比较基因组杂交

　　1.2.3.1 杂交混合液的制备　取60～100ng标记探针与5μg未标记Cot-1DNA、5μg鲑鱼精子DNA混合后用乙醇沉淀。然后将DNA溶于10μl杂交缓冲液［体积分数为50%甲酰胺、10%(W/V)硫酸葡聚糖、2×SSC，pH7.0］，70℃变性5分钟，37℃温育30分钟。

　　1.2.3.2　正常核型处理　70%去离子甲酰胺、2×SSC(pH7.0)，于70℃作用3分钟后按70%、85%、100%乙醇脱水，以0.1μg/ml蛋白酶K(溶于20mmol/LTris*HCl，2mmol/L CaCl₂，pH7.5)，37℃温浴7.5分钟，脱水同前。

　　1.2.3.3　杂交　杂交混合液滴于装片上，37℃，湿盒内避光杂交1～3天。杂交后以0.1×SSC，于60℃冲洗。

　　1.2.3.4　染色　5mg/L异硫氰荧光素(fluorescein isothio-cyanate，avidin-FITC)与Biotin标记探针结合产生绿色荧光；1mg/L抗地高辛罗丹明(anti-digoxigenin rhodamine)与地高辛标记探针结合产生红色荧光；标本用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)进行复染。

　　2　结果

　　43例原发性胃癌CGH分析结果显示3p(8/43)、8q(8/43)、20号染色体［20(9/43),20p(7/43)、20q(4/43)］、12q(16/43)、13q(12/43)为出现频率较高的扩增区域。而19号染色体［19(15/43)，19p(13/43)］、17号染色体［17(8/43)，17p(10/43)］、16号染色体(10/43)和1p(11/43)区域的缺失为胃癌的特征性变化，见表1。

表1　原发性胃癌比较基因组杂交分析结果

　　Tab 1　Comparative genomic hybridization analysis of primary gastric carcinomas

注：Normal(正常)

　　3　讨论

　　在43例胃癌的CGH分析中，有多条染色体特定带上出现肿瘤组织DNA杂交信号增强，其中包括8q23-q24.2、13q14-qter、12q24、1q21-qter、6p21-q13、3p14-qter、5q15-qter、7p15-qter、11q13-qter、20q11.2-q13.2、12q13-q15、20q、20p等，特别是3p(8/43)、8q(8/43)、20p(7/43)、20q(4/43)、12q(16/43)、13q(12/43)和20(9/43)号染色体这几个区域在肿瘤基因组DNA中扩增明显，说明这些区域中存在与胃癌发生发展密切相关的癌基因。Guan等^［3］曾发现乳癌中20q12-13.1(4/9)存在DNA序列扩增并以此为基础分离乳癌易感基因。在肝癌和乳癌中也曾发现8q区域的扩增^［4，5］。8q23-q24区域是myc基因的染色体定位区，我们发现8q扩增在胃癌中所占比例较高(8/42)，而且8q23-q24在2例标本中存在扩增。这说明除了myc基因之处还有位于8q的基因参与人类胃癌发生过程。12q13-q15扩增为很多肿瘤的特征，如肉瘤、脑瘤。Reifenberger等^［6］认为在恶性胶质瘤中12q13-q15区域的扩增意味着CDK4的过表达。Van de Ven等^［7］也发现12q13-q15的异常为多种实体瘤的特征，并将这种异常区域更精细地定位在RM36和RM103之间。我们的研究结果显示12q13-q15在胃癌中有明显的扩增，这与以上的研究结果相吻合，提示该区域存在与肿瘤发生密切相关的基因。

　　我们发现多条染色体的特定区带存在肿瘤组织DNA杂交信号明显减弱或缺失。1号染色体(11/43)、4号染色体(7/43)、5号染色体(5/43)、16号染色体(10/43)、17号染色体(18/43)、18号染色体(5/43)、19号染色体(28/43)、22号染色体(6/43)、X染色体(7/43)等都存在部分区域缺失。其中19号染色体［19(15/43)，19p(13/43)］、17号染色体［17(8/43),17p(10/43)］、16号染色体(10/43)和1p(11/43)区域的缺失为胃癌的特征性变化。特别是42例胃癌中28例涉及19号染色体部分区域的缺失；在有关19号染色体的结果中19pter-p13.1为出现频率较高的区域，目前尚无实体瘤中该区域异常的报道。Nakagawa等^［8］发现19p存在Peutz-Jeghers综合征(PJS)的易感基因，而Peutz-Jeghers综合征的特征为胃肠道的多发息肉并易患消化道恶性肿瘤。这可能提示19p上存在胃癌的抑癌基因。研究结果中18例样品涉及17号染色体部分区域的缺失；这与胃癌中常有p53基因的丢失有关。10例存在涉及16号染色体部分区域的缺失，Chung等^［9］认为16p上存在胰腺癌的易感基因。Terris等^［10］则在消化系统的神经内分泌肿瘤中利用CGH方法发现16p的缺失为其特征性变化。在10例伴转移的样品中，8例有19号染色体的缺失，其中5例为19p区域缺失。这提示19号染色体上存在与胃癌转移相关的基因。总之，我们在胃癌中所发现这些常见扩增和缺失区提示该区域存在与胃癌发生相关的癌基因和肿瘤抑制基因，这些区域是我们进一步克隆人类胃癌相关基因的候选染色体区域。

　　本课题受国家自然科学基金重大项目(39392900)资助

　　参考文献

　　1　　Miyoshi E, Uozumi N, Noda K, et al. Expression of alphal-6 fucosyltransferase in rat tissues and human cancer cell lines. Int J Cancer, 1997, 72(6)∶1117-1121.

　　2　　Guan XY, Jun X, Sarah L, et al. Hybrid selection of transcribed sequences from microdissected DNA: isolation of genes within an amplified region at 20q11-q13.2 in breast cancer. Cancer Res, 1996, 56(15)∶3446-3450.

　　3　　Guan XY, Meltzer PS, Dalton WS, et al. Identification of cryptic sites of DNA sequence amplification in human breast cancer by chromosome microdissection. Nature Genetics, 1994, 8(2)∶155-161.

　　4　　Parada LA, Hallen M, Tranberg KG, et al. Frequent rearrangements of chromosomes 1, 7, and 8 in primary liver cancer. Genes Chromosomes Cancer, 1998, 23(1)∶26-35.

　　5　　Fejzo MS, Godfrey T, Chen C, et al. Molecular cytogenetic analysis of consistent abnormalities at 8q12-q22 in breast cancer. Genes Chromosomes Cancer, 1998, 22(2)∶105-113.

　　6　　Reifenberger G, Ichimura K, Reifenberger J, et al. Refined mapping of 12q13-q15 amplicons in human malignant gliomas suggests CDK4/SAS and MDM2 as independent amplification targets. Cancer Res, 1996, 56(22)∶5141-5145.

　　7　　Van de Ven WJ,Schoenmakers EF, Wanschura S, et al.Molecular characterization of MAR, a multiple aberration region on human chromosome segment 12q13-q15 implicated in various solid tumors. Genes Chromosomes Cancer, 1995, 12(4)∶296-303.

　　8　　Nakagawa H, Koyama K, Tanaka T, et al. Localization of the gene responsible for Peutz-Jeghers syndrome within a 6-cM region of chromosome 19p13.3. Hum Genet, 1998, 102(2)∶203-206.

　　9　　Chung DC, Brwon SB, Graeme-Cook F, et al. Localization of putative tumor suppressor loci by genome-wide allelotyping in human pancreatic endocrine tumors.Cancer Res, 1998, 58(16)∶3706-3711.

　　10　　Terris B, Medded M, Marchio A, et al. Comparative genomic hybridization analysis of sporadic neuroendocrine tumors of the digestive system. Genes Chromosomes Cancer, 1998, 22(1)∶50-56.

(收稿：1998-12-29　　修回：1999-06-22)