维甲酸诱导基因RA538诱导人胃癌细胞系凋亡及其分子机制的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 临床免疫学

作者：陈洁平　林晨　徐采朴　邓友平　张雪艳　付明　程金科　吴竁

单位：陈洁平 徐采朴(第三军医大学西南医院消化科 重庆，400038)；林晨 邓友平 张雪艳 付明 程金科 吴竁(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生化室)

关键词：腺病毒；基因治疗；胃肿瘤；维甲酸；细胞凋亡

　　【 摘要 】　目的　研究全反式维甲酸（retinoic acid，RA）RA538诱导胃癌细胞的凋亡作用及其分子机制。方法　采用MTT、DNA梯度降解试验、原位末端标记、RT-PCR、Western blot等方法，对RA538重组腺病毒(Ad)在人胃癌细胞系中生物学作用及其分子机制进行体内外研究。结果　Ad-RA538对SGC7901细胞能产生明显的生长抑制效应，诱导SGC7901细胞凋亡。Ad-RA538生长抑制率为76.3%。Ad-RA538对SGC7901细胞产生的抑瘤效应及诱导凋亡作用是c-myc、bcl-2、bax、cyclin d1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果，其中对c-myc及bax表达的调节作用是在RNA和蛋白水平。而对p53、p16、TGase、ras基因的表达没有明显影响。经Ad-RA538处理的SGC7901细胞致瘤性消失。Ad-RA538对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度，生长抑制率为60.7%。结论　Ad-RA538对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用可能与抑制c-myc、bcl-2、cyclin d1基因及刺激bax基因表达的机制相关。与p53、p16、TGase及ras基因的表达无明显关系。

Studies on the apoptosis process and molecular mechanism of recombinant RA538 adenovirus on a human gastric cancer cell line——SGC7901

CHEN Jieping, lIN Chen, XU Caipu, et al.

　　(Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical university, Chongqing 400038, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　Studies on the apoptosis effects and molecular mechanism of recombinant RA538 adenovirus on human gastric cancer cell line in vitro and in vivo.Methods　Human gastric cancer cell line was treated respectively with Ad-RA538 and Ad-LacZ. MTT, dNA ladder, TUNEL, FCM, RT-PCR and Western blot were used.Results　Ad-RA538 could strongly inhibit cell growth and induce apoptosis of SGC7901 cells. The growth rate of the Ad-RA538-infected SGC7901 cells was inhibited by 76.3%. A series of expressions of c-myc, bel-2, bax and cyclin D1 and their interactions of each other resulted in SGC7901 cells growth inhibition and apoptosis, which were induced by RA538. Regulations for the expressions of c-myc and bax were at levels of RNA and protein, and there were no significant effects on expressions of p53, p16 TGase and ras. Treated with RA538, SGC7901 cells lost tumorigenicity. experimental therapy on the nude mice bearing subcutaneously transplanted tumor of SGC7901 cells showed that intratumor injections of Ad-RA538 inhibited the growth of the tumors. Ad-RA538-treated tumors were inhibited by 60.66%, compared with that of the tumor injected with Ad-LacZ and mock.Conclusion　Ad-RA538 can inhibit growth and induce apoptosis of gastric cancer cells in vitro and in vivo. RA538 makes effects on the expressions of c-myc, bcl-2, cyclin D1 and bax genes and leads to gastric cancer cells apoptosis finally.

　　【 Subject words 】　Adenovirus; gene therapy; Stomach neoplasms; Retinoic acid; Apoptosis

　　RA538为维甲酸(retinoic acid, RA)诱导基因^〔1〕。其确切作用及机制尚不清楚，部分研究结果表明，该基因有明显抑制恶性表型的作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡及下调c-myc基因表达^〔2〕。细胞凋亡是一个多基因参与的复杂过程，RA538基因对细胞凋亡相关基因表达的影响尚不清楚。本课题以胃癌细胞系作为靶细胞，研究腺病毒(adenovirus, ad)介导RA538诱导胃癌细胞凋亡作用及其分子机制，探索腺病毒介导RA538治疗胃癌的可行性，为胃癌的基因治疗提供候选基因，并为胃癌基因治疗的临床前研究提供实验依据。

　　材料与方法

　　细胞系及细胞培养：SGC7901细胞，为人胃腺癌细胞系（本室冻存）。用含10%胎牛血清的M199培养液培养。293细胞为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系（由詹启敏教授惠赠），用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。

　　重组体腺病毒制备：RA538及LacZ重组体腺病毒(Ad-RA538及Ad-LacZ)由中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体构建而成。采用Ad-RA538、Ad-LacZ经鉴定为阳性的重组体腺病毒，在293细胞中繁殖。将腺病毒以10×倍比稀释后，以293细胞进行滴度测定。提取病毒DNA，用一对RA538基因引物及一对腺病毒基因组引物进行PCR鉴定。

　　细胞生长曲线（MTT法）：采用96孔板，每孔接种细胞5?000～8?000个，24?h内按不同感染强度（multiplicity of infection, MOI）感染腺病毒。于不同时间点每孔加入MTT溶液（0.5mg/ml），4?h后弃去，另加入DMSO，振摇数分钟后酶标仪检测每孔吸光度（A）值。

　　细胞DNA梯度降解的检测：收集细胞，加裂解液400μl，离心取上清，加SDS至终浓度1%及RNA酶56℃作用2?h，乙醇沉淀DNA，干燥后溶于TE中，以琼脂糖凝胶电泳观察。

　　细胞凋亡原位检测（TUNEL试验）：按试剂盒方法进行。

　　流式细胞仪(FCM)分析：采用PI染色法。

　　逆转录PCR（RT-PCR）分析

　　细胞总RNA提取：按Promega公司的RNA gents^TM total RNA isolation system试剂盒说明分别提取并纯化细胞系的总RNA。

　　逆转录：采用Promega公司M-MLV逆转录试剂盒说明将细胞总RNA的mRNA逆转录成cDNA。

　　PCR条件：25μl体系中cDNA 2μl，10×PCR buffer，15mol/L MgCl₂，4种dNTPs各25μmol/L，每次加两对引物（目的基因及β-actin）各50pmol/L，Taq酶1U，反应在PCR仪中进行。95℃5?min，95℃ 1?min，56℃ 1?min，72℃ 1?min，28～30个循环。

　　PCR引物序列：β-actin上游 5′GCGGGAAATCGTGCGTGACATT 3′，下游5′GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG 3′。RA538上游 5′ATGGGTGAACAACAGAAGAG 3′，下游5′TTAGAGATTCAGATTTGGCT 3′。c-myc上游 5′CTCTCAACGACAGCAGCCCG 3′，下游5′AGGTGATCCAGACTCTGACC 3′。bax上游 5′GCGTCCACCCAAGAAGCTGAG 3′，下游5′ACCACCCTGGTCTTGGATCC 3′。bcl-2上游 5′TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG 3′，下游5′TCACTTGTGGCTCAGATAGG 3′。p53上游 5′TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA 3′，下游5′CTTAGCACCTGAAGGGTGAAATATTC 3′。p16上游 5′CATGATGATGGGCAGCGCC 3′，下游5′CAGGGTTTCTCAGAGCCT 3′。TGase上游 5′TGACTGAGGAGCAGAAGACG 3′，下游5′CTCGAAGTTCACCACCAGCT 3′。C-Ki-ras上游 5′ACGTGGCGGTAGTTGGAGGC 3′，下游5′CCTCTATTGTTGGATCATAT 3′。

　　Western blot分析：RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白。制备12% sDS-聚丙烯酰胺凝胶。采用Bio-Rad公司的垂直电泳装置进行电泳。按Bio-Rad公司转膜装置将蛋白样本转移至硝酸纤维膜上。电泳及转膜条件见产品说明书。杂交按Amershan公司的ECL western blotting kit 说明进行。将膜置暗盒中X光片曝光。

　　裸鼠致瘤性及皮下移植瘤模型治疗实验

　　裸鼠致瘤性：接种SGC7901细胞于60mm培养皿中，按MOI 100加入Ad-RA538或Ad-LacZ腺病毒，24?h内消化细胞，制成细胞悬液，10⁶/只接种于裸鼠右上肢背侧皮下。每组为3只5周龄鼠。连续观察肿瘤出现时间及体积，时间为1个月。

　　裸鼠皮下移植瘤模型：收集SGC7901细胞，制成10⁷ cell/ml细胞悬液，按100μl/只量接种于裸鼠皮下（5周龄鼠），待肿瘤长至5mm左右时，随机分组，每组5只，肿瘤内注射Ad-RA538或Ad-LacZ病毒液（10⁹单位病毒）或PBS0.1ml，隔日注射1次，共3次，连续观察肿瘤大小。

　　统计学分析：采用χ²检验及t检验。

　　结果

　　1.重组体腺病毒的制备：各种重组体腺病毒，经293细胞繁殖后制备成病毒贮存液，贮存于-70℃冰箱。重组体腺病毒滴度测定Ad-RA538、Ad-LacZ分别为：3.3×10¹⁰、3.3×10¹¹ PFU/ml。重组体腺病毒PCR鉴定：Ad-RA538显示腺病毒及RA538阳性扩增条带，Ad-LacZ显示腺病毒阳性扩增条带。

　　2.Ad-RA538对SGC7901细胞形态学影响及生长的抑制作用：以Ad-RA538 mOI 100感染SGC7901细胞，均于1～3?d开始出现细胞扩增聚集，变圆，胞浆中有空泡，4～5?d后细胞浮起。Ad-LacZ以MOI100感染时，细胞不出现明显的形态学变化。用MTT法显示Ad-RA538对SGC7901细胞生长抑制率为76.3%（MOI 200，8?d）。与Ad-LacZ组比P＜0.01。见图1。

　　3.Ad-RA538对SGC7901细胞的凋亡诱导作用：Ad-RA538可诱导SGC7901细胞凋亡。DNA梯度降解试验显示Ad-RA538作用2、4、6?d后均出现明显的DNA ladder现象(图2)。细胞凋亡原位检测法显示Ad-RA538处理的SGC7901出现明显凋亡(图3)。FCM分析SGC7901细胞经Ad-RA538及Ad-LacZ作用后G1期、G2 m期、S期百分比：12?h分别为74.6%、13%、12.4%及66.5%、15.3%、18.2%，4?d分别为39.7%、26.6%、33.8%及71.0%、12.4%、16.6%，6?d分别为44.4%，20.9%，34.7%及73.3%、8.4%、18.3%。显示RA538组12?h g1期阻滞，4?d、6?d S期及G2 M期阻滞。2?d开始出现凋亡高峰，2、4、6?d的凋亡峰分别为34.2%、18.2%、22%。

　　图1　Ad-RA538对SGC7901细胞的生长抑制作用（8?d)

　　Fig 1. Anti-proliferative effect of Ad-RA538 on SGC7901 cells(8 day)

　　图2　Ad-RA538感染后SGC7901细胞DNA梯度降解试验

　　Fig 2. DNA ladder of Ad-RA538 on SGC7901 cells

　　Lane 1: Ad-LacZ(2 d), Lane 2: Ad-RA538(2 d), Lane 3: Ad-LacZ(4 d), Lane 4: Ad-RA538(4 d), Lane 5: Ad-LacZ(6 d), Lane 6: Ad-RA538(6 d), Lane 7: φx174/HaeⅢ, Lane 8: λDNA/HindⅢ

　　4.Ad-RA538对SGC7901细胞基因表达的作用：提取Ad-RA538处理组1、3、5、7?d及对照组细胞总RNA，RT-PCR分析发现：在SGC7901细胞内未检测到内源性RA538的表达，经Ad-RA538处理后RA538表达显著增加，c-myc基因表达降低，bcl-2基因表达显著下降，bax基因表达明显增加，而p53、p16、TGase、ras基因表达均无明显变化。见图4。Western blot：分别提取Ad-RA538处理组1、3、5、7?d的细胞总蛋白。Western blot分析显示，Ad-RA538处理组c-myc基因表达均呈不同程度降低，而bax基因表达显著增高（见图5）。

　　图3　Ad-RA538感染后SGC7901细胞TUNEL凋亡分析(400×)

　　Fig 3. TUNEL analysis of SGC7901 cell infected with Ad-RA538(400×)

　　图4　RT-PCR分析Ad-RA538感染后SGC7901细胞RA538、c-myc、bcl-2、cyclin D1基因的表达

　　Fig 4. RT-PCR analysis expression of RA538, c-myc, bcl-2 and cyclin D1 gene of SGC7901 cell infected with Ad-RA538

　　Lane 1: φx174/Hae Ⅲ, Lane 2: cells control, Lane 3-6: 1 d, 3 d, 5 d, 7 d

　　图5　Western blot分析Ad-RA538感染后SGC7901细胞c-myc，bax基因蛋白表达

　　Fig 5. Western blot analysis expression of c-myc and bax gene of SGC7901 cell infected with Ad-RA538

　　Lane 1: cells control, Lane 2-5: 1 d, 3 d, 5 d, 7 d

　　5.Ad-RA538的裸鼠体内抗瘤效应

　　图6　SGC7901细胞重组腺病毒感染后裸鼠皮下致瘤实验

　　Fig 6. The tumorigenicity in nude mice of SGC7901 cell infected with recombinant adenovirus　　（1）裸鼠致瘤性：Ad-RA538组成瘤率为0，Ad-LacZ组及PBS组（Mock）成瘤率为100%（图6）。

　　（2）裸鼠皮下移植瘤模型：Ad-RA538对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型治疗结果显示1月后肿瘤较对照组明显缩小（P＜0.01），对肿瘤的生长抑制率Ad-RA538为60.66%（1月时），与Ad-LacZ组及Mock组比P＜0.01。

　　讨论

　　胃癌的发生是多因素、多阶段及多基因变异的综合病变过程。多种癌基因及抑癌基因的异常累积是癌变过程中的重要机制。选用抑癌基因RA538进行胃癌基因治疗的研究，主要基于如下考虑：首先RA538是采用全反式维甲酸（RA）诱导人食管癌细胞系，经消减杂交法得到的抑癌基因，已有的研究表明，RA538对恶性细胞具有广谱抑制作用^〔1，2〕。其次维甲酸对肿瘤细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用^〔3，4〕，RA538具有与维甲酸类似的作用。第三，胃癌细胞中c-myc基因高表达，RA538具有降调节c-myc的作用。我们采用RA538的重组腺病毒感染胃癌SGC7901细胞显示生长抑制率达76.3%，裸鼠体内实验显示，Ad-RA538处理后胃癌细胞无致瘤性，对皮下移植瘤生长抑制率为60.66%，表明Ad-RA538具有显著的抑制胃癌细胞恶性表型作用。同时观察到Ad-RA538能使SGC7901细胞形成明显的DNA ladder，原位末端标记及流式细胞仪均显示SGC7901细胞凋亡，表明导入关键的抑癌基因有可能通过阻止肿瘤细胞生长，诱导凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。

　　目前的资料认为，RA对许多癌基因的表达具有调节作用，同时还能恢复某些抑癌基因产物的活性^〔5〕。而细胞凋亡的产生与细胞的增殖、分化一样，本身就是一种基因表达的结果，许多癌基因与抑癌基因参与了这一过程。RA538为RA诱导产生的基因，我们的实验结果已经证明其对胃癌细胞具有诱导凋亡及抑制生长的作用。Bouillet等^〔6〕报道，使用消减杂交技术在p16胚胎细胞中发现了一个新的RA诱导基因Stra6，它可以诱导肿瘤细胞凋亡，与RA538基因的作用一致，但Stra6基因的作用机制不详。为了进一步探讨这一过程的分子机制，我们采用RT-PCR及Western blot的方法研究RA538基因的作用机制，结果显示：经Ad-RA538处理后胃癌细胞的c-myc基因表达降低。c-myc基因在细胞增殖、分化与细胞转化中起着重要作用，它既能促进细胞增殖，同时又可以诱导细胞凋亡。胃癌中有c-myc基因的扩增及高表达。通过RA538基因的表达实现了c-myc基因的降调节，从而诱导胃癌细胞凋亡，这与目前多数文献报道的在凋亡过程中c-myc基因表达增加不同^〔7〕。但也有资料显示反义c-myc可以诱导肿瘤细胞凋亡^〔8〕。还有文献显示，在小细胞肺癌中应用RA可以抑制其生长，同时使L-myc基因表达增加及c-myc基因表达减少^〔9〕。这与本研究中RA诱导基因RA538抑制c-myc基因表达的结果一致。出现这一结果可能的解释是，c-myc基因能诱导凋亡，但在c-myc高表达的肿瘤细胞，急剧的c-myc基因表达降低对其来说是致命的，同样可以导致凋亡。现有的研究发现，bcl-2高表达可以引起肿瘤并且能延长细胞的生存期，bcl-2基因及其蛋白可抑制多种细胞的凋亡，是细胞凋亡的潜在抑制子^〔10〕。bax与bcl-2具有同源性，而在细胞凋亡中其担负着与bcl-2相反的作用^〔11〕，我们发现RA538基因的表达可以促进bax的表达，而随着bax的表达，胃癌细胞出现凋亡，说明bax的高表达可以促进胃癌细胞的凋亡。这与文献报道bax在细胞中的作用一致^〔11〕。同时，还发现RA538基因的表达可以抑制bcl-2基因的表达，bcl-2的表达与bax的表达呈负相关，因此认为，bax可能是通过抵消bcl-2的活性而起作用的。此外还发现，RA538基因的高表达可以抑制cyclin d1基因的表达。cyclin D1作为一种细胞周期调控蛋白，具有调节细胞周期及促进细胞增殖的作用^〔12〕。因此，RA538的抑制胃癌细胞生长作用可能与cyclin d1表达抑制有关。由于p53、p16、TGase及ras基因均与肿瘤生长抑制或凋亡有关，本研究中也对RA538基因表达对它们的影响作了观察，结果显示p53、p16、TGase及ras基因的表达无明显变化，说明p53、p16、TGaes及ras基因可能没有参与Ad-RA538的诱导凋亡过程。详细机制尚待进一步研究。本研究表明，Ad-RA538对SGC7901细胞产生的抑瘤效应及诱导凋亡作用可能是c-myc、bcl-2、bax、cyclin d1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果，而与p53、p16、TGase、ras基因的表达没有明显关系。

　　基金项目：国家863高科技发展基金资助项目（Z20-01-02）

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(收稿日期：1999-09-16)