热休克蛋白HSP90β在人胃癌组织及耐药细胞系中的表达

　　第四军医大学学报2000年第21卷第2期

刘宪玲　叶苓　王建波　樊代明

　　摘　要：目的　了解热休克蛋白HSP90β在人胃癌组织及多药耐药细胞系中的表达.方法　SABC免疫组化法:70例胃癌组织,其中高分化腺癌13例，中分化腺癌32例，低分化腺癌18例，粘液癌7例(包括粘液腺癌和印戒细胞癌).正常胃粘膜17例，胃炎23例及癌旁组织35例作为对照.组织切片用正常羊血清封闭后，加入一抗（山羊抗人HSP90β多克隆抗体1∶200），4℃冰箱过夜;加二抗（生物素化兔抗山羊IgG 1∶200） 37℃ 30 min; 加SABC-过氧化物酶复合物(1∶100);DAB显色. mRNA原位杂交方法:探针变性后, 加至组织块上，37℃杂交48 h;依次用2×SSC,1×SSC,0.5×SSC反复振洗，加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体，NBT/BCIP呈色.结果　 HSP90β主要分布于组织细胞的胞质. 在非癌胃粘膜HSP90β为弱阳性表达.正常胃粘膜组织、胃炎（浅表性及萎缩性）及癌旁组织HSP90β的阳性表达率分别为11.8%, 13.0%及11.4%，各组之间无显著差异(P＞0.05). 在胃癌组织中HSP90β的表达明显增强,阳性表达率明显增高，阳性率为30.0%（P＜0.05）.其中在高、中、低分化腺癌及粘液腺癌中HSP90β的阳性率分别为15.4%,31.3%,33.3%及42.9%. hSP90β的表达有随组织分化程度降低而增高的趋势.在多药耐药细胞系SGC7901/VCR中HSP90β的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901.原位杂交结果可见HSP90β杂交阳性信号主要分布于组织细胞的胞质.结论　胃癌组织中HSP90β的表达显著高于非癌胃粘膜病变；在胃癌组织中，其表达随组织分化程度降低而增高.在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中，其表达显著高于其亲本细胞SGC701.

　　关键词：HSP90β；胃肿瘤；多药耐药；免疫组化；原位杂交

　　0　引言

　　热休克蛋白90（heat shock protein 90,HSP90）为生物进化过程中一高度保守的胞质蛋白质，约占胞质蛋白的1%～2%.在较高等的真核生物，HSP90有两种，即α型和β型，两者分别由730和724个氨基酸组成，其同源性为84%.它们分别由不同的基因编码. HSP90以同源二聚体αα,ββ形式存在于胞质，α型与β型的量大致相等.在应急状态下合成增加，可有少部分进入细胞核. HSP90α与HSP90β为构成型表达，应激状态下如高温，感染可诱导其生成增加，诱导因素不同，对α及β的诱导有所不同.相比之下，HSP90α易受热诱导，而HSP90β易受有丝分裂诱导.近年发现HSP90与肿瘤的关系比较密切. HSP90α可通过调节细胞周期促进细胞增殖，HSP90β能够抑制细胞分化^［1,2］.最近有人报道HSP90与(P-glycoprotein,PGP)的表达有关^{［ 3］}.我们用免疫组化方法及原位杂交方法研究HSP90β在人胃癌组织、人胃癌细胞系及相应的耐药细胞系中的表达，以探讨HSP90在胃癌发生、发展中的作用，及其HSP90与肿瘤耐药的关系.

　　1　材料和方法

　　1．1　材料　山羊抗人HSP90β多克隆抗体(美国 santa Cruz Biotechnology，Inc), 生物素化的兔抗山羊IgG及SABC试剂盒(武汉 boster Inc), 地高辛DNA标记和检测试剂(德国 Boehringer Mannheim Inc), phHSP90质粒(含人HSP90 cDNA，由Yamamoto Lab提供), 限制性内切酶HindⅢ等(华美生物工程公司)，RPMI1640培养粉，小牛血清. 胃癌组织标本70例取自西京医院病理科1995/1997存档的手术切除标本.全部标本均经100 mL^．L^-1福尔马林固定和常规石蜡包埋.经病理学证实，高分化腺癌13例，中分化腺癌32例，低分化腺癌18例，粘液癌7例(包括粘液腺癌和印戒细胞癌).以正常胃粘膜、胃炎（取自胃镜标本）及癌旁组织作为对照.人胃癌细胞系SGC7901及人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR由本所提供.

　　1．2　方法　常规细胞培养，用2.5 g^．L^-1胰酶消化SGC7901及SGC7901/VCR细胞，接种于置有载玻片的培养皿中，用含有100 mL^．L^-1小牛血清的RPMI 1640培养液，在50 mL^．L^-1 CO₂，37℃孵箱中培养.待细胞贴壁后继续培养24～48 h，0.01 mol^．L^-1 pBS洗涤，丙酮固定.

　　1.2.1　SABC免疫组化方法检测HSP90β的表达　石蜡切片常规脱蜡至水（细胞爬片无须脱蜡）3 mL^．L^-1 H₂O₂-甲醇封闭内源性过氧化物酶;0.01 mol^．L^-1 PBS洗涤;滴加正常羊血清封闭;加入一抗（山羊抗人HSP90多克隆抗体1∶200），4℃冰箱过夜;室温下复温1 h;加二抗 （生物素化兔抗山羊IgG 1∶200） 37℃ 30 min;加SABC-过氧化物酶复合物(1∶100);DAB显色，苏木精复染,常规脱水、透明、封片. 实验中用PBS及正常羊血清代替一抗作为空白对照.阳性部分呈棕褐色，依据呈色强弱及阳性细胞数分为阴性和阳性（-，+,,）.

　　1.2.2　mRNA原位杂交方法　探针制备参照《分子克隆操作指南》中的碱裂解法提取质粒phHSP90，经聚乙二醇沉淀法纯化后，用HindⅢ消化phHSP90质粒,可获得HSP905′端一段约1.4 kb的片段,用作目的探针.随机引物法标记探针按德国Boehringer Mannheim公司DIG-核酸标记和检测试剂盒操作说明进行.石蜡切片常规脱蜡至水，0.2 g^．L^-1 dEPC水浸泡，40 g^．L^-1多聚甲醛后固定30 min，用含0.3 mol^．L^-1醋酸胺的梯度乙醇逐级脱水;将用预杂交液稀释的探针100℃沸水加热10 min，-20℃骤冷5 min变性,加至组织块上，上面盖一硅化盖玻片，37℃杂交48 h;依次用2×SSC,1×SSC,0.5×SSC反复振洗，逐级乙醇脱水;20 mL^．L^-1正常小牛血清封闭;加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体检测;NBT/BCIP呈色;核固红染核，脱水，透明，封片.用相应的各种正常组织做阴性对照，免去加探针做空白对照.阳性部分成蓝紫色.

　　统计学方法：采用χ²检验.

　　2　结果

　　2．1　胃癌组织HSP90β的表达　HSP90β棕褐色阳性信号主要分布于组织细胞的胞质(Fig1,2). 在非癌胃粘膜组织(正常胃粘膜组织，浅表性胃炎、萎缩性胃炎、不典型增生及癌旁组织)可见到HSP90β的弱阳性信号.正常胃粘膜组织、胃炎（浅表性及萎缩性）及癌旁组织HSP90β的阳性表达率分别为11.8%,13.0%及11.4%，各组之间无显著差异(P＞0.05). 在胃癌组织中HSP90β的阳性信号明显增强,阳性表达率明显增高，阳性率为30.0%, 显著高于前3组（P＜0.05，Tab1）. 在高分化胃腺癌中HSP90β的阳性率15.4%,中分化腺癌为31.3%,低分化腺癌为33.3%,粘液腺癌为42.9% (Tab 2). 各组比较有显著差异，χ²检验P＜0.05. hSP90β主要分布于胃癌细胞的胞质中（Fig 2）.在分化较高的胃癌组织中，其表达的阳性率较低,阳性信号也较弱.在分化较低的癌组织, 阳性率较高,阳性信号也较强.在转移的淋巴结中也可见弱阳性信号.

表 1　不同胃癌组织HSP90β的表达

　　tab 1　HSP90β expression in gastric cancer tissues　　　(n)

Gastric 　　mucosa	n	Intensity				Positive 　　rate（%）
		-	+
Normal	17	15	2	0	0	11.8
Gastritis	23	20	2	1	0	13.0
Para-cancer	35	31	3	1	0	11.4
Cancer	70	49	8	9	4	30.0

表 2　不同分化程度胃癌组织HSP90β表达

　　tab 2　HSP90β expression in gastric cancer tissues

　　with different differentiation　　　　(n)

Histologic 　　differentiation	n	Intensity				Positive 　　rate（%）
		-	+
Well	13	11	2	0	0	15．4
Moderately	32	22	4	5	1	31．3
Poorly	18	12	1	3	2	33．3
Mucous carcinoma	7	4	1	1	1	42．9

图 1　免疫组化法检测HSP90β在人胃炎组织中的表达,HSP90β位于腺上皮细胞质

　　fig 1　HSP90β expression in human gastritis tissues.

　　hSP90β is localized in the plasma of the glandulous epithelial cells　×200

图 2　免疫组化法检测HSP90β在人胃癌组织中的表达,HSP90β位于癌细胞质

　　fig 2　HSP90β expression in human gastric cancer tissues.

　　hSP90β is localized in the plasma of the cancer cells　×400

　　2.2　SGC7901/VCR中HSP90β的表达　多药耐药细胞SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901的胞质均可见棕褐色颗粒，在SGC7901/VCR中染色较强，且在核中也可见有少量褐色颗粒.提示HSP90β在耐药细胞及其亲本细胞中均有表达，但在耐药细胞中的表达更强.

　　2.3　原位杂交结果　HSP90β杂交阳性信号主要分布于细胞的胞质，呈蓝紫色颗粒.在正常胃粘膜及慢性胃炎胃腺上皮细胞内有蓝紫色阳性杂交信号(Fig3). 在胃癌组织HSP90β杂交阳性信号较强(Fig 4). 在耐药细胞中HSP90β杂交阳性信号也明显增强.

图 3　HSP90β mRNA在人胃炎组织中的表达,用HSP90β反义探针进行原位杂交,阳性信号位于胞质

　　fig 3　HSP90β mRNA expression in human gastritis tissues.

　　in situ hybridization for HSP90β with anti-sense probe.

　　positive signal is localized in the plasma of the cells　×400

图 4　HSP90β mRNA在人胃癌组织中的表达,用HSP90β反义探针进行原位杂交,阳性信号位于胞质

　　fig 4　HSP90β mRNA expression in human gastric

　　cancer tissues. In situ hybridization for HSP90β

　　with antisense probe. Positive signal is localized

　　in the plasma of the cells　×400

　　3　讨论

　　热休克蛋白为生物体内普遍存在的蛋白质，在多种因素刺激及诱导下，细胞可合成HSP，以抵御有害物质对组织细胞的损伤.肿瘤为组织细胞在致癌物质刺激下发生恶性增殖的结果.对肿瘤发生后HSP是否被诱导及其意义的研究可能为攻克肿瘤提供线索. jameel等^［4］研究了HSP90α在人乳腺癌组织中的表达,发现所有组织均有HSP90α表达，而恶性乳腺组织HSP90α表达明显增高.在卵巢癌中也发现HSP90 mRNA表达增加，病情越严重，HSP90 mRNA越高^［5］.最近，在患者子宫内膜中检测了HSP90的表达^［6］，发现子宫内膜癌中有29%的病例HSP90呈高表达. yano等^［1］最近研究了HSP90在乳腺癌组织的表达及作用，发现HSP90α mRNA在乳腺癌组织的表达明显高于非癌组织，HSP90α mRNA的表达与增殖细胞核抗原标记指数（PCNA lI）密切相关，这表明HSP90α高表达在细胞增殖中具有重要意义. hSP90β mRNA在分化不良的癌组织中表达明显高于分化良好的乳腺癌组织.即HSP90α可能与肿瘤组织的增殖有关，HSP90β与肿瘤的分化程度有关.在胰腺癌中，HSP90α呈选择性高表达，细胞中存在大量的HSP90α mRNA；而HSP90β为组成型表达. 在急性白血病细胞中HSP90 mRNA表达水平增高，诱导分化后HSP90表达明显被抑制.小鼠胚胎肉瘤细胞HSP90α在诱导分化后表达下降，而HSP90β无变化.在胃癌组织中的表达情况至今尚无报道. 我们研究发现，HSP90β在人正常胃粘膜组织及胃炎均有弱阳性表达，阳性表达率为11.8%及13.0%.但在胃癌组织中表达增强. 阳性表达率明显增高（30.0%）.在分化不同的组织其表达不同. 在高分化的组织，HSP90β的表达较弱；在低分化的组织，HSP90β的表达较高. hSP90β在高、中、低分化腺癌及粘液细胞癌中的阳性率分别为15.4%,31.3%, 33.3%及42.9%. HSP90β的表达有随组织细胞分化程度降低而增高的趋势.也进一步证明HSP90β与肿瘤的关系比较密切. 在癌旁组织可见HSP90β弱表达，阳性表达率为11.4%.结合前人的研究，肿瘤组织HSP增高可能是一普遍现象. 也提示HSP90β可以作为肿瘤标记物，用于预测肿瘤的预后.

　　肿瘤多药耐药是肿瘤细胞对化疗药物的适应性反应，可观察到多种蛋白质的表达和(或)酶活性的改变.肿瘤细胞通过这些蛋白质的改变保护自身免受抗肿瘤药物的破坏.1996年Bertram 等^［3］研究发现MDR阳性表型细胞系LoVoDxR中HSP90β的表达与其对柔红霉素的耐药有关.我们发现，在多药耐药的胃癌细胞系SGC7901/VCR，其HSP90β的表达明显高于其亲本细胞SGC7901，且在耐药细胞的核中也有表达.说明HSP90β参与SGC7901/VCR细胞系的耐药，VCR可能诱导了HSP90β的表达.

　　基金项目：国家自然科学基金资助课题(39570806);国家杰出青年基金课题(3952020)

　　作者简介：刘宪玲(1962-)，女(汉族)，陕西省西安市人.主治医师，博士. Tel.(029)3375227　Email. isabelliu412@yahoo.com刘宪玲（第四军医大学西京医院　消化病研究所）　叶苓（病理科,陕西 西安 710033）　王建波（病理科,陕西 西安 710033）　樊代明（第四军医大学西京医院　消化病研究所）

　　参考文献：

　　［1］Yano M, Naito Z, Tanaka s et al. Expression and roles of heat shock proteins in human breast cancer［J］. jpn J Cancer Res，1996;87(3):908-915.

　　［2］Yamada T, Nakamura R, Kido K et al. Function of hsp90 in differentiation and apoptosis of human EC cells［J］. Trans Soc Pathol Jpn, 1995; 84(1):217.

　　［3］Bertram J, Palfner K, Hiddemann W et al. Increase of P-glycoprotein-mediated drug resistance by hsp90 beta［J］. Anticancer Drug,1996;7(2):838-845.

　　［4］Jameel A, Skilton RA, Campbell TA et al. Clinical and biological significance of HSP90α in human breast cancer［J］. Int J Cancer,1992;50(2):409-415.

　　［5］Mileo AM, Fanuele M, Battaglia F et al. Selective overexpression of mRNA coding for 90 kDA stress protein in human ovarian cancer［J］. Anticancer Res,1990;10(3):903-906.

　　［6］Nanbu K, Konshi I, Komatsu T et al. Expression of heat shock proteins hSP70 and HSP90 in endometrial carcinomas［J］. Cancer, 1996; 77(1):330-338.