人胃癌转移鼠模型的构建及移植瘤的阶段性研究

临床与实验病理学杂志 1999年第4期第15卷 实验研究

作者：邓华　孙宁　唐慰萍　邓惠华　莫梅英　蔡琼珍　李飞虹

单位：邓华　唐慰萍　邓惠华　莫梅英　蔡琼珍　李飞虹（广州市儿童医院病理科，广州　510120）；孙宁（广东医学院病理学教研室，湛江　524023）

关键词：胃肿瘤；肿瘤移植；疾病模型；动物；小鼠；裸；转移鼠

　　摘要　目的：建立人胃癌的“转移鼠”模型，为研究胃癌转移打下基础。方法：将人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞悬液先在裸小鼠皮下接种成瘤，再取瘤组织块分别接种到裸鼠的皮下、胃壁上（转移鼠模型），分早（＜20天）、中（20～40天）、晚（＞40天）3个阶段观察移植瘤的生长及侵袭转移情况。结果：皮下组移植成瘤率为82.1％（23/28），早、中阶段未见转移，晚期肺转移率57.1％（4/7）。胃壁组移植成瘤率为86.9％（20/23），早期、中期未见转移，晚期肺、肝和胃周淋巴结转移率都为50.0％（3/6），并广泛侵犯其他器官。结论：“转移鼠”模型能模拟临床胃癌病人的发展过程，转移是一个晚期事件。

　　分类号　R735.2； R73-352　　文献标识码　A

　　文章编号　1001-7399(1999)04-0327-03

The construction of human gastric carcinoma metamouse model and the study on phases of transplantation tumor

Deng Hua,

　　(Dept of Pathol, Guangzhou Children Hospital, Guangzhou　510120)

　　Sun Ning, Tang Weiping et al

　　(Dept of Pathol, Guangdong Medical College, Zhanjiang　524023)

　　ABSTRACT　Purpose　To construct metamouse model of human gastric carcinoma, which will provide us with a basis to study gastric carcinoma metastasis.Methods The cell suspensions of human gastric poor differentiated mucinous adenocarcinoma, MGC-803, were inoculated into nude mice subcutis. Then, the histologically intact xenograft tissues were transplanted to subcutic of nude mice, stomach wall (so called metamouse), respectively. The biological characteristics of the ecotopic and orthotopic xenografts in three periods early(＜20 d), middle(20～40 d) and advanced(＞40 d)) were observed.Results The take-rate of the subcutaneous transplantation group was 82.1%(23/28). Metastasis did not happen in the early and middle phases but the incidence of pulmonary metastasis was 57.1%(4/7) in the advanced period. In contrast, the take-rate of the stomach wall transplantation group amount to 86.9%(20/23), also, metastasis was observed only in the advanced period. Lung, liver and stomach regional lymph node metastases were all of the same incidence, 50.0%(3/6), and there existed extensive spread to other organs.Conclusion　Metamouse model closely correlates with the course of the tumor in the clinical patients and tumor metastasis is a late incident.

　　KEY WORDS stomach neoplasms; neoplasm transplantation; disease models, animal; mice, nude; metamouse

　　人类肿瘤在免疫缺陷动物的移植模型经历了以下3个发展阶段：（1）癌细胞悬液皮下接种；（2）癌细胞悬液原位接种；（3）完整瘤组织块原位接种即“转移鼠”（metamouse）模型。采用癌细胞悬液的方式破坏了癌组织的原有结构，导致肿瘤生物学行为和自然属性改变，结果影响了人类肿瘤细胞的移植生长和转移^〔1〕。转移鼠模型是近几年来一个令人注目的原位移植方式。它既有原位移植的优点，又保持了癌组织的完整结构，故比癌细胞悬液的原位接种拥有较高的移植生长率和转移率^〔2〕，是一种更为接近临床病人征象的模型。胃癌是我国常见的恶性肿瘤，人胃癌转移鼠模型的建立无疑有助于我们对胃癌转移的进一步认识。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　NIH品系裸小鼠（nu/nu）由本室SPF裸鼠室提供，鼠龄4～8周，体重15～20 g，雌雄兼用，饲养于隔离室恒温恒湿层流架中，饲以灭菌水和饲料。

　　1.2　方法　将本室冻存的人胃低分化粘液腺癌细胞系MGC-803复苏置于37℃ 5％ CO_２培养箱中培育，生长液含85％ RPMI 1640、 15％小牛血清、1％青链霉素、1％NaHCO_３，隔日传代，待生长液变黄，镜下观察细胞生长良好时，用0.5％胰酶+0.2％EDTA（1∶4）于室温下消化10 s后，吹打成细胞悬液，收集备用。癌细胞悬液按每只1×10^６/0.3 ml的剂量接种到裸小鼠近腋右背侧皮下至成瘤，观察肿瘤生长情况并统计成瘤率。当移植瘤直径达1 cm时（接种30～35天），取活力好的瘤组织块，经1640液漂洗，剪成1～2 mm^３大小之碎块备用。所有接种按无菌操作进行，将完整瘤组织块分两组接种：皮下移植组（以下简称皮下组），用套管针吸取1块组织块接种于近腋背侧皮下。胃壁移植组（以下简称胃壁组），2％戊巴比妥钠30 mg·kg^-1腹腔麻醉，将麻醉鼠固定于手术板上，常规消毒，铺洞巾，于左上腹开一纵形切口长约1 cm，打开腹腔将胃轻轻提出。用眼科剪于胃大弯腺胃处将胃浆膜开一3 mm长的小口，而后将一1～2 mm^３大小之瘤块置于肌层和浆膜层之间，荷包缝合包埋好瘤组织块^〔3〕。将胃回纳于腹腔，关腹，缝皮，待苏醒后置于层流架饲养，每周观察2次。观察两组移植瘤发生发展情况，计算成瘤率。分3阶段（20 天以内、20～40天、40天至衰竭期）处死成瘤鼠，详细检查浸润转移情况。取肿瘤组织、全肺、肝、脾、双肾和颈浅、颈深、纵隔、臂、腋窝、贲门、幽门、肾门、髂动脉旁、髂动脉间、腹股沟及肠系膜淋巴结，10％福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，全肺作连续切片。

　　1.3　统计方法　数据资料作χ^２检验。

　　2　结果

　　2.1　细胞悬液的皮下移植瘤　接种20只，仅6只成瘤，成瘤率30.0％。另有9只出现移植瘤自发消退现象，消退时最大瘤结节为0.6 cm×0.5 cm，消退时间多为出现肉眼可见皮下瘤结节后7～14天，最长时间为30天。

　　2.2　完整瘤组织块的皮下移植　接种28只，成瘤23只，成瘤率82.1％，早、中期移植瘤活动性大，色红润。晚期移植瘤活动性小，结节状，瘤结节最大达4.5 cm×3.0 cm，表面可见溃疡，切面灰白，境界清楚，坏死程度不等。镜下癌细胞片块状、巢状，结缔组织分隔，不形成腺样结构，粘液较少，核大不规则，核膜厚，见病理性核分裂象，间质血管壁薄，腔大弯曲，有些仅由一层内皮细胞形成不规则腔隙，瘤细胞与管壁紧密粘附，出现肺转移的小血管内见大量癌细胞形成癌栓并突破管壁生长。早期（8只）、中期（8只）成瘤鼠未见转移。晚期（7只）有4只出现肺转移（转移率57.1％），肺转移的4只中有一只裸鼠的右腹股沟淋巴结门部见大量癌细胞，被膜完整，边缘窦未见癌细胞。

　　2.3　完整瘤组织块的胃壁移植　接种23只，成瘤20只，成瘤率86.9％。接种2～3周即可在左上腹触及一小硬结，晚期出现蛙状腹。分阶段处死成瘤鼠，早期和中期移植瘤于胃壁上浸润性生长，与其他脏器无明显粘连，少数胃周淋巴结、肠系膜淋巴结肿大。晚期极度衰弱，开腹见血性腹水，肿瘤突向腹腔，色灰白或半透明，表面有粘液，与大网膜、结肠、肝、胰、脾广泛粘连，肝脏可见多个绿豆大瘤结节（图1），少数肿瘤甚至突破膈肌生长。镜下细胞形态结构类似于皮下移植瘤，但粘液较皮下移植瘤多，有些癌细胞呈条索状排列，少数有腺样结构，偶见淋巴管内瘤栓。随着荷瘤时间的延长，肿瘤从肌层向粘膜层侵犯，破坏胃壁结构（图2）。出现肺转移的肺小静脉内见癌栓，管壁周围可见散在癌细胞团（图3）。肝脏内可见转移灶，肿瘤中央坏死。有的转移淋巴结大部分结构被癌细胞破坏，仅见少量淋巴细胞。早期（8只）、中期（6只）成瘤鼠未见血道转移，肿大淋巴结为反应性增生，未见转移。晚期（6只），肺转移3例（转移率50.0％），肝转移3例（转移率50.0％），胃周淋巴结转移3例（转移率50.0％）。各实验组结果见表1。

图1 肿瘤结节状,与内脏广泛粘连,肝表面见多个瘤结节.

图2 肿瘤侵犯至粘膜下层,基底膜尚完整.HE×100

图3 肺小血管内见大量癌细胞形成瘤栓,管壁外周见散在癌细胞HE×400

表1　各实验组成瘤及转移情况

　　ND：No Detect; 与悬液组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.013　讨论

　　研究癌侵袭和转移的一个重要方法就是在免疫缺陷动物建立相应的动物模型，近些年来出现的“转移鼠”模型是利用完整瘤组织块原位接种构建而成的，它能更好地模拟临床肿瘤病人的发生发展过程。本实验中与癌细胞悬液的接种方式相比，利用完整瘤组织块无论是皮下接种还是原位接种，都有较高的成瘤率，自发消退现象少且节省材料。组织块皮下接种的移植瘤镜下呈片块状或巢状，无腺样结构，粘液也少，这与最初王凯华建立的低分化粘液腺癌细胞系在裸鼠移植瘤上表达的生物学特征已有所改变^〔4〕，这可能与MGC-803在体外反复冻存、传代有关。胃壁移植瘤部分癌细胞呈条索状排列，少数有腺样结构并有较多粘液，提示胃壁的微环境在一定程度上能恢复MGC-803原来的某些特征，胃环境优于皮下环境。皮下接种多局限性生长且很少产生淋巴道转移，而本实验中原位移植瘤除了广泛扩散至肝、脾、肠和肾脏外还出现了淋巴结转移现象，现在认为瘤细胞与瘤细胞之间以及瘤细胞与基质之间的相互作用能影响肿瘤生物学行为的表达^〔5，6〕，完整组织块保证了种子结构的完整性，原位移植则提供了合适的土壤，胃壁丰富的血管、淋巴管、特有的识别粘附作用和局部生长因子是胃壁移植瘤出现广泛侵袭和多器官转移的重要原因^〔7，8〕。胃癌一般以淋巴道转移为主要途径，后期多为血道转移，本实验构建的人胃癌的转移鼠模型能模拟临床胃癌病人的发展过程，是研究胃癌转移的理想动物模型。完整瘤组织块无论是皮下接种还是原位接种在早期、中期都无转移产生，而仅在荷瘤40天以后才出现，故认为转移是一个晚期事件。本实验皮下移植瘤有1例在移植瘤的同侧腹股沟淋巴结（右侧）仅在门部发现转移之癌细胞，门部是血管、神经、输出淋巴管出入淋巴结的通道，此处的癌细胞可由输出淋巴管逆流进入淋巴结，也可从门部的营养血管进入淋巴结；而与癌细胞从输入淋巴管—边缘窦—中央区这一淋巴结转移的一般过程不同，表明癌细胞转移到淋巴结也可能来自血道。

　　作者简介：邓　华，男，28岁，硕士

　　孙　宁，男，53岁，教授，硕士生导师。研究方向：鼻咽癌的病因研究

　　参考文献

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　　5，XinYu F, Fiorella G, Robert M et al. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:5645～5649

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收稿日期：1998-07-17

　　修回日期：1998-10-09