胃癌中癌基因ras c-myc mRNA表达的临床意义

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 研究原著

作者：施秀清¹　李　功¹　李春生¹　倪灿荣²　栾　汛¹　曲　阳¹

单位：1解放军203医院消化内科　黑龙江省齐齐哈尔市　161000;2第二军医大学病理教研室

关键词：基因，ras；基因，MYC；RNA，信使/分析；基因表达；胃肿瘤/遗传学

Oncogene ras, c-myc mRNA expression in gastric carcinoma and its clinical significance

　　SHI Xiu-Qing¹, LI Gong¹, LI Chun-Sheng¹, NI Chan-Rong², LUAN Xun¹ and QU Yang¹

　　¹Department of Gastroenterology, Department of Pathology Chinese PLA 203 Hospital, Qiqihaer 161000

　　²Department of Pathology, the 2nd Military Medical University, Shanghai

　　Subject headings　genes, ras; genes, myc; RNA, messenger/analysis; gene expression

　　 AbstractAbstract

　　AIM　To study the independent and combined effects of ras and c-myc mRNA expression in the tumor occurrence and to seek evidence for early diagnosis of gastric carcinoma.

　　METHODS In situ hybridization histochemistry(ISH) was used to examine the expression of H-ras, K-ras, C-myc mRNA in 88 cases of gastric carcinoma tissue, and an analysis with clinical data was made.

　　RESULTS K-ras, h-ras and C-myc mRNA expression rate in the tumor tissues was 78.4%， 70.5% and 58.0%, and it was 28.4%，27.3% and 20.5% in the neighboring regions of the tumor respectively, with a tendency of step-down. The oncogene expression was not related to clinical and pathological type and the metastasis to lymph nodes. C-myc mRNA expression was closely related to the survival time of patients (P＜0.05).

　　CONCLUSION K-ras, h-ras and C-myc mRNA expression is a valuable reference for the early diagnosis of gastric carcinoma.

　　中国图书资料分类号　R735.2

　　摘　要

　　目的　探索癌基因ras和c-myc mRNA在胃癌发生中单独和协同作用关系，选择胃癌的早期诊断依据.

　　方法　应用原位分子杂交(ISH)技术，检测88例胃癌组织中H-ras，K-ras, c-myc mRNA的表达，结合临床资料综合分析.

　　结果　K-ras,H-ras,C-myc mRNA在肿瘤区的阳性表达分别为78.4%，70.5%和58.0%，在癌旁区的阳性表达分别为28.4%，27.3%和20.5%，呈梯度下降趋势，3种癌基因的表达与胃癌的临床分型、组织学分类及有无淋巴结转移无关，C-myc mRNA的表达与患者生存期关系密切(P＜0.05).

　　结论　K-ras,H-ras,C-myc mRNA的表达可作为胃癌早期诊断的参考依据.

　　0　引言

　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其生存率的提高有赖于搞好二级预防，以及时地检出癌前病变或早期癌. 目前胃癌的基础研究已进入了分子和基因水平阶段. 作者应用原位分子杂交技术检测88例胃癌肿瘤区、移行区和癌旁区粘膜的癌基因K-ras,H-ras和C-myc mRNA的表达，并与正常粘膜组织对照，旨在探讨其在胃癌的发生、发展中各自和协同作用关系、作用范围、阶段和从分子水平估计预后，为选择胃癌的早期诊断和治疗方法提供依据.

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　胃癌组织88例均系本院1990年以来胃癌手术切除标本；男62例，女26例，年龄35岁～70岁，平均53.2岁；临床分型：蕈伞型9例，溃疡型50例，浸润型29例；组织学分类：高分化腺癌10例，中分化腺癌39例，低分化腺癌30例，粘液腺癌9例；正常粘膜5例. 有随访结果53例，其中术后生存期＞3a者29例，＜3a者24例.

　　1.2　方法

　　1.2.1　标本制备　胃癌组织标本均严格按标准取材后固定在40g/L多聚甲醛(1g/L DEPC消毒水配制)18h，150g/L蔗糖缓冲液浸泡标本24h，均用新鲜乙醇、二甲苯脱水、透明、包埋，4μm石蜡切片，切片时尽量避免RNasc污染.

　　1.2.2　探针与标记　K-ras, H-ras, C-myc(均由日本国立预防研究所小山浩赠送)，生物素标记缺口平移Kit购自美国Enzo公司，按说明书方法操作^［1，2］.

　　1.2.3　操作步骤　切片用新鲜乙醇，二甲苯脱蜡至无菌水中，无菌PBS洗，按文献报道适当修改的方法进行^［3，4］，微波三挡浸在缓冲柠檬酸盐(0.01mol/L，pH 6.0)中5min×2(95℃)，蛋白和核酸分离，PBS洗，蛋白酶K(2mg/L)，37℃，30min，PBS洗，40g/L多聚甲醛固定5min;PBS洗，乙醇脱水，2.5g/L乙酸酐(内含0.1mol/L三乙醇胺9g/L NaCl,pH 8.0)洗10min. 预杂交：0.5kg/L去离子甲酰胺：2×ssc 42℃,3h;杂交：杂交液中内含探针浓度2mg/L，5ml去离子甲酰胺，2ml 20×ssc， 0.5ml 10g/L变性鲑精DNA，2ml 0.5kg/L硫酸葡聚糖，0.2ml 50×Denhardt, k-ras, H-ras和C-myc cDNA探针45℃杂交18h. 杂交后洗，均生物素化，抗生物素抗体1∶1000， 37℃ 1h，ABC复合物1∶100，37℃ 40min，DAB-HO显色8min. 结果判定标准及对照设计，参考有关文献^［5，6］.

　　2　结果

　　K-ras,H-ras和C-myc mRNA在胃癌中的表达见表1-4.

　　表1　癌基因mRNA在胃癌中的表达

　　表2　癌基因mRNA在不同类型胃癌中的表达

　　表3　癌基因mRNA表达与淋巴结转移

　　表4　癌基因mRNA表达与术后生存的关系

　　3　讨论

　　应用原位分子杂交技术对88例胃癌组织检测的结果表明，K-ras,H-ras,C-myc mRNA在肿瘤区的阳性表达率分别为78.0%，70.0%和58.0%；癌旁组织及移行区正常粘膜上皮的阳性表达率分别为28.4%，27.3%，20.5%和18.2%，17.0%，19.3%，正常粘膜均呈阴性反应，与肿瘤区相比差异均有非常显著意义(P＜0.01)；阳性表达从肿瘤区至癌旁区正常粘膜呈梯度下降趋势. 上述结果提示，胃癌细胞具有癌基因的激活、突变，与文献报道^［7-10］结果一致. 癌旁粘膜上皮也有K-ras,H-ras和C-myc阳性表达，提示该区已有癌基因的突变和激活，细胞已非属正常细胞，有恶性转化的可能. 3种癌基因mRNA表达与肿瘤的分化程度及临床分型无统计学意义(P＞0.05). 与淋巴结有无转移无关(P＞0.05). c-myc基因定位于人类8号染色体上，其编码Mr 62 000产物有直接调节其他基因转录作用. Ninomiya et al^［10］应用C-myc产物检测213例胃癌，其阳性率为23.5%，浸润型生长者多见，但与淋巴结转移，组织学类型及血管、淋巴管侵犯无关. 本研究应用C-myc探针检测88例胃癌中mRNA的表达，其阳性率要高于Ninomiya等的报道，同样与淋巴结转移，组织学类型无关. k-ras,H-ras,mRNA在胃癌中的表达与肿瘤患者的生存期无关，而C-myc mRNA表达与患者的存活期关系密切(P＜0.05)与文献报道一致^［7-10］.

　　总之，细胞癌变是多癌基因变异累积的结果. 因此对多癌基因检测的高表达，可作为胃癌患者早期诊断的一个有价值的参考依据，对临床治疗具有一定的指导意义.

　　施秀清，女，1947-10-18生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族. 1972年毕业于延边医学院医疗系，主治医师，感染控制科主任，主要从事消化疾病的诊治研究.

　　通讯作者　施秀清，161000，解放军203医院消化内科，黑龙江省齐齐哈尔市建设大街59号.

　　Correspondence to: Dr. SHI Xiou-Qing, Department of Gastroenterology, Department of Pathology, Chinese PLA 203 Hospital, 59 Jianshe Street, Qiqihaer 161000, Heilongjiang Province, China

　　Tel. +86*452*2112355-4431

　　收稿日期　1997-05-06　修回日期　1997-09-03

　　4　参考文献

　　1　倪灿荣. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京：北京科学技术出版社，1993：261-269

　　2　苏慧慈. 原位杂交. 北京：中国科学技术出版社，1994：34-51

　　3　Chan F, Yeger H, Pawlin G, Arriza JL, Swanson LW, Simmons DM et al. in situ hybridization of mRNA with biotin and digoxigenin labeled probes. J Histotechnol, 1994;17(3):301-306

　　4　Can FY, Luk CD, Cesell MS, Sawchenko PE, Swanson LW, Davis LG et al. Nonradioactive in situ hybridization technioues for routinely prepared pathology specimel and cultured cells. J Histotechnol, 1994;17(3):313-319

　　5　王江，倪灿荣. P53, ras P21,c-erbB-2癌基因蛋白在胃癌中的表达及分布特征. 第二军医大学学报，1994；15(1)：20-22

　　6　Viaene AL, Baert JH. Localization of cytokeratin 4 mRNA in human oesophageal epithelium by non-radioactive in situ hybridization. Histochem J, 1994;26(1):50-54

　　7　Tatsuta M, Iishi H, Baba M, Nakaizumi A, Uehara H, Taniguchi H et al. Expression of c-myc mRNA as an aid in histologic differentiation of adenoma from well differentiated adenocarcinoma in the stomach. Cancer, 1994;73(7):1795-1799

　　8　Houldsworth J, Cordon-corido C, ladanyi M, Kelsen DP, Chaganti RS. Gene amplification in gastric and esophageal adenocarcinoma. Cancer Res, 1990;50(22):6417-6422

　　9　Czerniak B, Herz F, Corczyca W, Koss LG. Expression of ras oncogene P21 protein in early gastric carcinoma and adjucent gastric epithelia. Cancer, 1989;64(6):1467-1473

　　10 Ninomiya I, Yonemura Y, Matsumoto H, Sugiyama K, Kamata T, Miwa K et al. Expression of c-myc gene product in gastric carcinoma. Oncology, 1991;48(1):149-154