胃癌及其癌前病变中细胞凋亡与细胞增殖间关系的研究

世界华人消化杂志 1999年第8期第7卷 特约评论

作者：刘海峰　刘为纹　房殿春

单位：第三军医大学西南医院消化科　重庆市　400038

关键词：胃肿瘤；癌前状态　细胞凋亡；增殖细胞核抗原

　　中国图书馆分类号　R735.2

　　摘　要

　　目的　通过观察胃癌及其癌前病变中细胞凋亡与细胞增殖间的关系，探讨细胞凋亡在胃癌发生中的作用.

　　方法　利用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色对10例正常胃粘膜、16例萎缩性胃炎、36例肠化生、20例异型增生和53例胃癌中的凋亡细胞、增殖细胞进行原位观察和比较.

　　结果　萎缩性胃炎、肠化生、异型增生中凋亡细胞指数(11.9%；14.7%，8.0%)均显著高于正常胃粘膜和胃癌(3.5%，5.8%，t=2.058～7.901，P＜0.01～P＜0.05)；异型增生、胃癌与肠化生相比，凋亡细胞明显减少、增殖细胞明显增多(P＜0.05)；胃癌细胞增殖指数(47.5%)显著高于异型增生(30.1%，P＜0.01). 胃癌前病变及胃癌组织中的凋亡细胞指数与增殖细胞指数呈显著相关(r=0.966，-0.897，P＜0.05).

　　结论　胃粘膜癌变过程中不仅存在活跃的细胞增殖，而且存在细胞凋亡异常. 高增殖能力的细胞可能通过选择而占据优势，导致胃癌的发生. 细胞凋亡与细胞增殖平衡失调在胃癌发病中可能起重要作用.

Study of the relationship between apoptosis and proliferation in gastric carcinoma and its precancerous lesion

LIU Hai-Feng, LIU Wei-Wen and FANG Dian-Chun

　　Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　Subject headings　stomach neoplasms; precancerous conditions; apoptosis; proliferative cell nuclear antigen

　　Abstract

　　METHODS　Using terminal deoxynucleotidyl transferase_mediated nick end labelling (TUNEL) technique and PCNA immunohistochemical staining, we observed the apoptotic cells and proliferating cells in situ in 10 normal gastric mucosa, 16 chronic atrophic gastritis, 36intestinal metaplasia, 20 gastric dysplasia and 53 gastric carcinomas.

　　RESULTS　The apoptotic indexes in atrophic gastritis, intestinal metaplasia and gastric dysplasia (11.9%， 14.7%， 8.0%) were significantly higher than those in normal mucosa and gastric carcinoma (3.5%， 5.8%， t=2.058-7.901，P＜0.01-0.05). Comparison of intestinal metaplasia with gastric dysplasia and gastric carcinoma showed that apoptotic cells decreased and proliferating cells increased significantly. The PCNA index in gastric carcinoma (47.5%) was significantly higher than that in gastric dysplasia (30.1%， P＜0.01).

　　CONCLUSION　Apoptosis may play a role in selection of clonal subpopulations with high growth potential resulting in malignant transformation. Abnormal regulation of apoptosis may play an important role in the pathogenesis of gastric carcinoma.

　　0　引言

　　细胞凋亡是机体胚胎发育和组织更新过程中清除细胞的主要途径，细胞凋亡过程的异常与肿瘤发生有密切关系^［1］. 既往认为胃癌形成是细胞无限增殖所致的细胞积聚，近年发现胃癌中不仅存在细胞增殖，同时也存在细胞凋亡^［2，3］. 因此，了解胃癌前病变和胃癌组织中细胞凋亡与细胞增殖间的关系，有助于揭示胃癌发生的机制. 我们采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色对正常胃粘膜、萎缩性胃炎、肠化生、异型增生和胃癌组织中的细胞凋亡. 细胞增殖现象进行原位观察，以期揭示胃粘膜癌变过程中细胞凋亡与细胞增殖间的关系，以及细胞凋亡在胃癌发生中的作用.

　　1　材料和方法

　　1.1　研究对象　收集我院1994/1996内镜活检标本及胃癌手术切除标本共135例. 其中含大致正常胃粘膜10例，萎缩性胃炎16例，肠化生36例，异型增生20例，胃癌53例. 内镜活检标本均取自胃窦部，53例胃癌均为胃远端癌. 胃癌患者在手术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗. 组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片. 并经HE染色病理诊断证实.

　　1.2　染色方法

　　1.2.1　TUNEL染色　细胞凋亡原位检测试剂盒(in situ cell death detection kit, POD)为德国Boehringer Mannheim公司产品. 染色步骤：①切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；②3mL/L H₂O₂封闭30min；③20mg/L蛋白酶K消化液作用20min；④TUNEL反应液，37℃孵育60min；⑤过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，37℃孵育30min；②-⑤步后均以10mmol/L PBS(pH 7.4)振洗三次，每次5min；⑥DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片. 以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照，阳性对照切片经DNascI预处理10min，再接TUNEL染色步骤.

　　1.2.2　PCNA免疫组化染色　PCNA单克隆抗体及免疫组化试剂盒(Immunostain SP kit)均为美国Santa Cruz公司产品. 石蜡切片常规脱蜡、水化，继以免疫组化试剂盒检测，染色程序按SP法操作常规进行. 抗PCNA单抗1∶100稀释. 以PBS替代一抗作为空白对照， 正常血清替代一抗作为替代对照. 用已知阳性切片作为阳性对照.

　　1.3　观察指标　光镜下观察TUNEL染色及PCNA免疫组化染色切片的显色反应，数5个以上高倍视野，不少于500个细胞，计数阳性细胞数，分别作为TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)指数及PCNA阳性细胞(增殖细胞)指数.

　　统计学处理　所得数据资料均以均数±标准差表示. 采用t检验、直线相关分析.

　　2　结果

　　2.1　胃癌前病变及胃癌组织中TUNEL及PCNA染色的形态学特点　TUNEL染色阳性物质呈棕黄色，主要位于细胞核内，常聚集于核膜附近或核质呈现均匀的染色，少许细胞浆内亦有淡着色. 在正常胃粘膜，凋亡细胞主要位于表层上皮中；萎缩性胃炎、肠化生及异型增生组织中的凋亡细胞数量明显增多，在粘膜全层均有表达；胃癌组织中的凋亡细胞数量明显减少，凋亡细胞呈单个散在分布和(或)簇状分布(图1). 切片中常可见到呈棕黄色着色的凋亡小体，散在分布.

　　PCNA染色阳性物质呈棕黄色细颗粒状均匀分布，主要位于细胞核内. 在正常胃粘膜，PCNA阳性细胞主要是较均匀的间断出现于胃粘膜腺颈部增殖带，数量少；萎缩性胃炎、肠化生组织中的PCNA阳性细胞亦主要分布于胃粘膜腺颈部增殖带，但在粘膜上层细胞亦有表达；异型增生组织中的PCNA阳性细胞主要分布于粘膜上层(包括表层上皮)中，PCNA阳性细胞数量明显增多，PCNA阳性细胞在胃癌组织中呈弥漫性分布，其阳性级别较高，着色较强(图2).

图1　胃癌组织中凋亡细胞数量减少，呈簇状分布. TUNEL染色×200

图2　胃癌组织，增殖细胞数量明显增多，呈弥漫性分布. SP×200

　　 2.2　胃癌前病变及胃癌组织吕的凋亡细胞指数　萎缩性胃炎、肠化生及异型增生组织中的细胞凋亡指数均显著高于正常粘膜和癌(P＜0.01及P＜0.05)；异型增生组织中的细胞凋亡指数显著低于萎缩性胃炎及肠化生(P＜0.01及P＜0.05)；胃癌细胞调亡指数显著高于正常粘膜(P＜0.01). 见表1.

表1　胃正常粘膜、胃癌前病变及胃癌中凋亡细胞指数　　(%，±s)

^aP＜0.05， ^bP＜0.01.

　　2.3　胃癌前病变及胃癌组织中的增殖细胞指数　从正常胃粘膜、萎缩性胃炎、肠化生、异型增生到胃癌的PCNA指数呈递增趋势，相差均具有统计学意义(P＜0.01). 见表2.

表2　胃正常粘膜、胃癌前病变及胃癌中的增殖细胞指数　　(%,±s)

^bP＜0.01，vs 正常胃粘膜组；^dP＜0.01，vs 萎缩性胃炎组；^eP＜0.01，vs 肠化生组； ^hP＜0.01， vs 异型增生组.

　　2.4　胃癌前病变和胃癌组织中细胞凋亡与细胞增殖间的关系　经直线相关分析表明，从正常胃粘膜、萎缩性胃炎到肠化生，细胞凋亡指数与细胞增殖指数呈显著正相关(r=0.966，P＜0.05)；从肠化生、异型增生到胃癌，细胞凋亡指数与细胞增殖指数呈显著负相关(r=-0.897，P＜0.05).

　　3　讨论

　　已有研究表明，肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，也是细胞凋亡异常的疾病，在多种致癌因子作用下，细胞增殖增强及(或)细胞凋亡的抑制是肿瘤形成及肿瘤浸润和转移的生物学基础^［4，5］. 但对于胃粘膜癌变过程中细胞凋亡与细胞增殖间的关系，尤其是它们在癌前阶段的特点尚少见文献报道. 本研究发现，从正常胃粘膜→萎缩性胃炎→肠化生，细胞凋亡指数及细胞增殖指数均呈递增的趋势，细胞凋亡与细胞增殖呈正相关；而从肠化生→异型增生→胃癌，细胞凋亡指数递减，细胞增殖指数仍呈递增的趋势，细胞凋亡与细胞增殖呈负相关. 这种变化规律表明，在胃粘膜上皮恶性转化的癌前阶段存在着活跃的细胞增殖和大量的细胞凋亡，即细胞群的不稳定性明显增加. 随着恶性转化程度的提高，增殖细胞比例逐渐上升，凋亡细胞比例逐渐下降，使细胞的积聚速度加快. 这种细胞增殖与细胞凋亡比率的变化提示，在胃粘膜癌变过程中可能存在一种“细胞选择性增殖”现象，其表现为既有细胞的大量增殖，又有细胞的不断凋亡，在此过程中，某些细胞得以保留并继续增殖，另一些细胞则通过细胞凋亡而被“淘汰”. 高增殖力的细胞可能通过这种选择占据优势，形成高增殖性的稳定的细胞群体，细胞凋亡明显减少，细胞积聚速度明显增加，使肿瘤生长加快并表现出恶性行为^［6-8］. 胃粘膜癌变过程中出现的“细胞选择性增殖”的机制尚不清楚，可能与细胞凋亡的基因调控失常有关，具体机制有待进一步的研究.

　　综上所述，胃粘膜癌变过程中不仅存在细胞过度增殖，而且存在细胞凋亡的异常. 胃粘膜癌变的启动阶段可能存在活跃的细胞增殖和大量细胞凋亡共存的现象，而推进阶段则可能以细胞增殖为主，细胞凋亡退居其次. 细胞过度增殖和(或)细胞凋亡减少是胃癌发生的生物学基础. 细胞凋亡与细胞增殖平衡失调在胃癌发生中可能具有重要意义.

　　作者简介：刘海峰，男，1965-11-06生，河北省景县人，汉族. 1988年第三军医大学医疗系毕业，1995年第三军医大学医学博士，讲师，主治医师. 目前主要从事消化系病诊治研究工作，发表论文22篇，综述8篇.

　　军队医药卫生九五重点课题资助项目，No.96Z047

　　通讯作者　刘海峰，400038，重庆市高滩岩正街30号，第三军医大学西南医院消化科.

　　Supported by Key Project of the Fund for Army Medical and Health 9th 5_year plan.

　　Correspondence to:LIU Hai-Feng, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　Tel. +86·23·65318301 Ext.73049

　　Email. hfliuwz@ public.cta.cq.cn

　　4　参考文献

　　1　Solary E, Dubrez L, Eymin B. The role of apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Eur Respir J, 1996;9:1293-1305

　　2 Kasagi N, Gomyo Y, Shirai H, Tsujitani S, Ito H. Apoptotic cell death in human gastric carcinoma: analysis by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling. Jpn J Cancer Res, 1994;85:939-945

　　3 Ishida M, Gomyo Y, Ohfuji S, Ikeda M, Kawasaki H, Ito H. Evidence that expression of a mutated p53 gene attenuates apoptotic cell death in a human gastric intestinal-type carcinoma in vivo. Jpn J Cancer Res, 1997;88:468-475

　　4 Korsmeyer SJ. Apoptosis regulation and oncogenesis. Proccedings of Am Assoc Cancer 　Res, 1996;37:624-632

　　5 Que FG, Gores GJ. Cell death by apoptosis: basic concepts and disease relevance for the gastroenterologist. Gastroenterology, 1996;110:1238-1243

　　6 Bedi A, Pasricha PJ, Akhtar AJ, Barber JP, Bedi GC, Giardiello FM, Zehnbauer BA, Hamilton SR, Jones RJ. Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer. Cancer Res, 1995;55:1811-1816

　　7　孙宝存，赵秀兰，慧京，章明放，王钦, 张乃鑫. 大肠癌及其癌前病变中细胞凋亡与细胞增殖间关系的原位观察. 中华医学杂志, 1996;76:848-851

　　8 Tsujitani S, Shirai H, Tatebe S, Sugamura K, Ohfuji S, Gomyo Y, Maeta M, Ito H, Kaibara N. Apoptosis cell death and its relationship to carcinogenesis in colorectal carcinoma. Cancer, 1996;77:1711-1716

收稿日期　1999-06-20