胃泌素受体拮抗剂抑制胃癌细胞生长的可行性研究

中国胃肠外科杂志 1999年第4期第2卷 论　著

作者：黄广建　王和明　张延龄

单位：上海医科大学华山医院外科

　　关键词： 胃泌素受体拮抗剂；胃癌；治疗

　　【摘要】　目的　探讨应用胃泌素受体拮抗剂治疗胃癌的可行性。方法　在体外条件下观察胃泌素及其受体拮抗剂丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅的细胞活力、细胞内cAMP浓度及细胞凋亡的影响；在体内条件下观察胃泌素受体拮抗剂丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅移植瘤的面积、重量及胃癌细胞DNA的影响。结果　在体外条件下，胃泌素能促进胃癌细胞株MKN₄₅的增殖，细胞内cAMP浓度增高，细胞凋亡百分率降低，而丙谷胺能完全阻断胃泌素的作用。在体内条件下，丙谷胺能抑制胃癌细胞株MKN₄₅移植瘤的生长，肿瘤面积、重量及胃癌细胞DI、DNA含量、SPF均低于对照组。结论　胃泌素受体拮抗剂能够抑制胃泌素受体阳性的胃癌细胞生长，有望为胃癌的治疗提供一种新手段。

The feasible study of gastrin receptor antagonist

　　to inhibit the growth of gastric cancer

HUANG Guangjian, WANG Heming, ZHANG Yanling. Department of General Surgery, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the effect of a gastrin receptor antagonist in the treatment of gastric cancer.Methods　The level of cell vitality, intracellular cAMP concentration and cell apoptosis rate of gastric cancer cells MKN₄₅ was measured in vitro under the use of gastrin and gastrin receptor antagonist proglumide respectively. The xenotransplanted tumor areas, weight and the DNA content of gastric cancer cells MKN₄₅ in vivo was observed under the use of proglumide.Results　In vitro, gastrin promoted the cell proliferation of gastric cancer cells MKN₄₅ with higher intracellular cAMP level and lower cell apoptosis rate. Proglumide could interrupt the effect of gastrin. In vivo, proglumide inhibited the growth of xenotransplanted gastric cancer cells MKN₄₅. Tumor area, weight, DNA index, DNA content and S phase fraction of gastric cancer was lower in proglumide group than that in control group.Conclusion　Gastrin receptor antagonist can inhibit the growth of gastric cancer with positive gastrin receptor, which may offer a new way in the treatment of gastric cancer.

　　【Key words】　Gastrin receptor antagonist　Gastric cancer　Treatment

　　近年来的基础实验研究发现，消化道肿瘤以自分泌或旁分泌方式促进肿瘤的生长，籍此说明胃癌无限制增殖的机制^［1］。胃泌素被认为是其中的一种自分泌生长因子，由此推想应用胃泌素受体拮抗剂能达到抑制胃癌细胞增殖的目的。本实验研究胃泌素受体拮抗剂丙谷胺在体内、体外条件下对胃癌细胞生长的抑制作用。

　　材料与方法

　　一. 材　料

　　胃癌细胞株MKN₄₅；噻氮唑蓝(MTT，购自Sigma公司)，5肽胃泌素(上海东风生物技术公司)，丙谷胺(购自Sigma公司)，cAMP-RIA试剂盒(由上海医药大学提供)，Annexin-V(德国Boehringer Mannheim公司)，酶联免疫测定仪，流式细胞仪，γ-计数仪，20号套管针，游标卡尺；裸小鼠(BALB/c-nu/nu)，正压层流柜SPF条件下饲养(洁净度100级)。

　　二. 方　法

　　(一)体外实验

　　1. 胃癌细胞培养及药物配制　胃癌细胞株MKN₄₅体外细胞培养，0.5%小牛血清RPMI₁₆₄₀培养液中分别加入灭菌的胃泌素、丙谷胺、胃泌素加丙谷胺、5-FU，分成5组：空白对照组，胃泌素组(Gs 25 μg/mL)，丙谷胺组(PGL 32 μg/mL)，胃泌素加丙谷胺组(Gs 25 μg/mL+PGL 32 μg/mL)，5-FU组(5-FU 10 μg/mL)。

　　2. 细胞活力的测定　应用噻氮唑蓝(MTT)比色分析法测定细胞活力。取100 μL含细胞的培养液(细胞浓度为1×10⁵/mL)，接种于96孔培养板，细胞贴壁后吸去培养液；按上述分组分别加入培养液、胃泌素、丙谷胺、胃泌素加丙谷胺及5-FU各100 μL，各组均设8个复孔。培养66小时后每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，继续培养6小时，离心弃上清液，每孔加20%十二烷基硫酸钠(SDS)100 mL，震荡5分钟，置室温半小时后在酶标仪上测定570 nm波长处的吸光度(A)值。

　　3. cAMP含量的测定　细胞培养及分组、加药同上，细胞浓度为1×10⁶/mL，每孔500 μL，接种于24孔培养板。培养30分钟后用放射免疫分析法测定cAMP浓度。

　　4. 胃癌细胞凋亡百分率的测定　细胞培养及分组、加药同上，细胞浓度为1×10⁶/mL，培养48小时后收集细胞，PBS洗涤2次，加2 μL培养液制成细胞悬液，上机前离心弃上清液，再以PBS 洗涤2次，碘化丙啶染色，Annexin-V标记，在流式细胞仪上测定凋亡细胞百分率。

　　(二)体内实验

　　1. 实验用药的配制　对照组：羧甲基纤维素0.4 g，在无菌条件下以0.9%氯化钠溶液200 mL溶解成0.2%羧甲基纤维素助悬剂。治疗组：PGL 5 g及羧甲基纤维素0.4 g，在无菌条件下逐渐加0.9%氯化钠溶液共200 mL，研磨成均匀的混悬液。治疗对照组：5-FU 240 mg加0.9%氯化钠溶液80 mL，无菌配制。

　　2. 胃癌动物模型的建立　取含有细胞的培养液70 μL(细胞数1×10⁷)，接种于裸鼠右腋背交界处皮下层内成瘤，瘤块反复接种2次，形成胃癌细胞株MKN₄₅的动物模型。取雄性裸小鼠随机分成3组，每组6只；传代的肿瘤在放大镜下剪成大小一致的立方体状瘤块，约2 mm×2 mm×2 mm大小，以套管针分别接种于裸鼠右前腋背交界处皮下。

　　3. 胃泌素受体拮抗剂的应用　各组均自瘤块接种后第1天开始用药。对照组：每只裸鼠腹腔内注射羧甲基纤维素助悬剂200 μL，每日2次，共治疗28天。PGL组：每只裸鼠腹腔内注射PGL混悬液200 μL，每日2次(相当于每只裸鼠每天予PGL 500 mg/kg)，共治疗28天。5-FU组：为治疗对照组，每周用药1次，相当于每只裸鼠每周予5-FU 45 mg/kg。

　　4. 疗效观察　第5天时肿瘤开始形成，用游标卡尺测量每只裸鼠荷瘤的最长径及垂直径，隔天测量1次；第28天时裸鼠全部存活，取出肿瘤并称重；肿瘤印片采用美国CAS200型图像细胞仪行DNA图像分析。

　　(三)统计学处理

　　各组差别用t检验。

　　结　果

　　一. 胃泌素、丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅细胞活力的影响

　　各组A₅₇₀值间接反映活细胞数量。结果表明胃泌素组活细胞数明显高于对照组(P＜0.01)，丙谷胺对细胞生长无影响(P＞0.05)，但胃泌素与丙谷胺联合应用后能使胃泌素组细胞数明显下降(P＜0.01)，接近于对照组细胞数(表1)。

　　二. 胃泌素、丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅细胞内cAMP浓度的影响

　　如表1所示，胃泌素组细胞内cAMP浓度明显高于对照组(P＜0.01)，合用丙谷胺后该作用消失，而单用PGL及5-FU对细胞内cAMP浓度无影响。

表1　胃泌素、丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅细胞

　　　活力及细胞内cAMP浓度的影响　(±s)

　　三. 胃泌素、丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅细胞凋亡的影响

　　应用Annexin-V标记细胞膜上凋亡期特征性改变磷脂酰丝氨酸，测定细胞凋亡百分率，发现胃泌素组细胞凋亡百分率明显低于对照组(P＜0.01)，合用丙谷胺后该作用消失，而丙谷胺本身对细胞凋亡无影响(P＞0.05)。本研究同时发现5-FU可明显诱导胃癌细胞的凋亡(表2)。

表2　胃泌素、丙谷胺对胃癌细胞株MKN₄₅细胞凋亡的影响　(±s)(%)

　　四. 体内实验各组瘤体面积大小

　　从图1可见，接种第5天已有肿瘤生长，测量各组肿瘤面积，大小相近，无显著性差异(P＞0.05)，表明肿瘤生长的均一性好。从第16天始PGL组肿瘤面积较对照组明显缩小，差异有显著性(P＜0.05)；第28天时PGL组肿瘤面积较对照组更小，PGL对肿瘤生长抑制作用与5-FU的作用相仿。

图1 各组肿瘤面积随时间的变化曲线

　　五. 体内实验各组肿瘤的重量

　　比较第28天时各组肿瘤重量，发现PGL组及5-FU组肿瘤重量分别为(847.9±69.6)mg、(814.5±52.8)mg，较对照组(1 177.7±183.5)mg明显减轻(P＜0.005)。

　　六. 体内实验各组胃癌细胞DNA的变化

　　各组胃癌移植瘤行DNA图像分析，DNA指数(DI)及平均DNA含量在PGL组均明显降低(P＜0.001)，S期细胞比率(SPF)在PGL组较对照组减少，差异具有显著性(P＜0.05)。可见PGL能影响胃癌细胞DNA的合成，并改变胃癌细胞的分裂周期(表3)。

表3　丙谷胺及对照组胃癌细胞DNA的变化(±s)

　　讨　论

　　胃癌细胞能自分泌生长因子，作用于自身或邻近的胃癌细胞膜上特异性受体，从而不断地刺激胃癌细胞的增殖。我们利用胃泌素受体阳性的胃癌细胞株MKN₄₅作为研究对象，发现胃泌素能明显促进胃癌细胞的增殖，胃泌素作用半小时后细胞内cAMP浓度明显升高，而胃泌素受体拮抗剂丙谷胺能阻断胃泌素的作用，说明胃泌素是通过与胃癌细胞膜表面胃泌素受体结合，激活了细胞内腺苷酸环化酶，激活了cAMP依赖性蛋白激酶，使其底物cAMP反应素磷酸化成一种蛋白结合的特异性DNA活性序列，改变了基因转录过程。

　　我们的研究发现胃泌素受体拮抗剂丙谷胺能完全阻断外源性胃泌素的促增殖作用，在受体水平阻断了胃泌素激发的细胞内第二信使传导信号，而丙谷胺本身对胃癌细胞增殖及细胞内cAMP浓度无影响，结果与文献报道丙谷胺对胃泌素受体阳性的胃癌细胞株有抑制作用不一致^［2］。许多实验发现体外培养的癌细胞株在反复传代过程中可能丧失某些生物学特征，如丧失自分泌胃泌素或胃泌素前体的特征，因此胃癌细胞的生长不依赖胃泌素的刺激，丙谷胺就不再发挥作用；当加用外源性胃泌素后丙谷胺仍能通过阻断胃泌素受体拮抗胃泌素的作用。在体内条件下，胃癌细胞往往能恢复其生物学特性，丙谷胺能明显抑制胃癌细胞株MKN₄₅移植瘤的生长，肿瘤面积、重量明显低于对照组，说明只要胃癌自分泌生长过程中有胃泌素的参与，且胃癌细胞膜表面有胃泌素受体表达，丙谷胺就能发挥抑制胃癌细胞生长的作用。

　　丙谷胺抑制胃癌生长的作用并不象化疗、放疗等直接杀伤肿瘤细胞。我们以Annexin-V标记细胞膜上底物早期特异性改变磷脂酰丝氨酸测定凋亡细胞百分率，发现胃泌素组细胞凋亡明显低于对照组；应用丙谷胺阻断胃泌素作用后细胞凋亡增加，说明细胞内第二信使cAMP改变基因转录后，使基因调控下的细胞程序性死亡发生改变。体外实验表明丙谷胺组凋亡细胞数虽略高于对照组，统计学无差异，但可完全阻断胃泌素抗凋亡作用，阻断后的凋亡细胞数仅次于5-FU，而死亡细胞数明显低于后者，说明丙谷胺主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥牢固抗肿瘤作用。体内实验表明，丙谷胺能改变胃癌细胞核代谢过程，使胃癌细胞核合成减慢，DNA含量降低，并影响到肿瘤细胞的分裂周期，使处于分裂的肿瘤细胞减少，进一步完善了PGL的抗肿瘤生长机制。

　　体内、体外实验表明，丙谷胺作为一种胃泌素受体拮抗剂，能够抑制胃泌素受体阳性的胃癌细胞增殖，并诱导胃癌细胞的程序性死亡。我们另外的研究发现^［3］，胃体癌表达胃泌素受体的阳性率为77.8%，胃底贲门癌为50.0%，而胃窦癌为20.1%；且晚期胃癌易于表达胃泌素受体。因此对部分不能切除的胃癌或胃癌术后患者，应用胃泌素受体拮抗剂治疗，有望能抑制胃癌的生长，为胃癌的治疗提供了一种途径。

　　参考文献

　　1　Ciccotosto GD,Mcleish A,Harley KJ,et al.Expression,processing and secretion of gastrin in patient with colorectal carcinoma.Gastroenterology 1995;109:1142-1153.

　　2　Piontek MK,Hengels KJ.Differention mode of action of high and low affinity CCK/gastrin receptor antagonist in growth inhibition of gastrin-responsive human gastric adenocarcinoma cells in vitro.Anticancer Res 1993;13:715-720.

　　3　黄广建，张延龄，乐竹琴，等.胃癌表达胃泌素受体的特征.中华消化杂志 1999；19：104-106.

(收稿：1999-08-02　修回：1999-10-18)