吐温80合并温热对人胃癌细胞热耐受性和HSP70表达的影响
癌症 1999年第0期第18卷 基础研究
作者：陈斌，杨虎川，杨耀琴，朴文姬，陶惠红
单位：上海铁道大学医学院肿瘤细胞学研究室(上海200070)
关键词：胃肿瘤；高热；诱发；膜活化剂；热休克蛋白；热耐受性；BGC－823细胞
【摘要】目的：观察吐温80合并41℃温热对BGC823细胞热耐受性和Hsp70表达的影响。方法：吐温80合并41℃作用后不同时间43℃再作用，测定细胞生长曲线、克隆形成率，并运用免疫组化、WesternBlotting等方法分析细胞Hsp70的表达。结果：(1)41℃温热诱导后BGC823细胞形成的热耐受性包括两部分：一部分为即时、非Hsp70依赖的，另一部分为Hsp70依赖的热耐受性；(2)41℃诱导后即时，Hsp70表达并未改变；8h达到高峰(P＞0.05)；(3)合并作用后，细胞的热耐受性及Hsp70的表达均受到明显抑制(P＜0.01）。结论：吐温80合并温热对肿瘤细胞热耐受性和Hsp70表达的抑制作用，可能与两者对肿瘤细胞质膜系统的协同作用有关。
中图号：R739.5文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)s0－0030－04
The influences of Tween 80 in combination with hyperthermia on the thermotolerance and HSP70 expression of the
human gastric tumor cell line BGC－823
CHEN Bin， YANG Hu-chuan，YANG Yao-qin, et al.
Tumor Cell Lab,College of Medicine,Shanghai Tiedao University,Shanghai 200070,P.R.China
【Abstract】Objective： To observed the changes of the thermotolerance and Hsp70 expression of the human gastric tumor cell line BGC－ 823 after the combined treatment of Tween 80 and 41℃ hyperthermia.Methods： At different times after the combined treatment of Tween 80 and 41℃ hyperthermia,the cell line BGC-823 was heated at 43℃ for 60 min.The cell survival curve and cloning efficiency were measured. The Hsp70 expression of the cell line were observed by means of immunocytochemistry and Western-Blotting.Results： 1).The thermotolerance of BGC 823 cell line induced by hyperthermia(41℃ 60 min)included two parts:① One part was Hsp70 independent and induced immidiately after the treatment,② the other Hsp70 dependent.2).Hsp70 expression did not increase immidiately after 41℃ hyperthermia,Hsp70 expression increased to the peak at 8h after the treatment,and mostly in the nucleus(P＜0.01),recovered to the normal level at 24h.3).The combined treatment could obviously suppress the thermotolerance and expression of Hsp70(p＜0.01).Conclusions:The inhiition of the Hsp70 expression of the cell line by Tween 80 in combination with hyperthermia may be due to the synergisitic effects of Tween 80 and hyperthermia on the plasma membrane system of the tumor cells.
Key words： Gastric tumor; Hyperthermia induced; Membrane active agent; Thermotolerance Heat shock protein(Hsp); BGC 823
由于温热作用的独特性以及与其他治疗的互补性和协同性，温热治疗已经成为现代肿瘤治疗的主要方法之一。但是温热作用之后，细胞表达一类特殊的蛋白质—热休克蛋白(heatshockproteinHSP)，并形成对热的耐受性或抵抗性，从而降低温热疗效〔1，2〕。除HSP之外，细胞膜作为温热作用的重要靶部位，也参与了热耐受性的形成〔2〕。本文通过动态检测吐温80合并41℃温热作用后BGC823细胞热耐受性和Hsp70表达的变化，来探讨吐温80合并温热杀伤、抑制肿瘤细胞的机制，为膜活化剂吐温80作为新型温热合并药物应用于肿瘤临床治疗提供可靠依据。
1材料与方法
1.1细胞培养
采用BGC-823人胃癌细胞系(北京市人民医院建株)；培养液为含15％FCS的RPMI1640，加适量双抗，pH72；5％CO2培养箱37℃培养；取指数生长期细胞用于实验。
1.2加热方法
细胞由37℃培养箱取出，立即置入自制精密加热水浴箱(HH.W12型水浴箱加设精密控温系统及水循环装置，温差±01℃)中加热，完毕后立即换液、回培养箱培养；生长曲线、免疫组化细胞加热，用密封25ml培养瓶在水浴箱直接加热，液体量为2ml(WesternBlotting用50ml培养瓶加热，液体量8ml)，升温至41℃、43℃时间均需5分钟；克隆形成率细胞加热，将24孔板放入铝盒、密封后加热，41℃升温时间需8分钟、43℃需10分钟；以上升温时间均由加热总时间扣除。
1.3分组
实验组：细胞接种24h后，加吐温80(上海大众制药厂，批号84001，用生理盐水稀释至10％，高压灭菌)至终浓度0.1％，47h进行41℃60分钟温热作用，换液后，按所设时间间隔给予43℃60分钟处理。实验对照组包括41℃＋43℃对照、吐温80等相应对照组；空白对照组：37℃培养。
1.4测试指标
1.4.1克隆形成率：细胞接种于24孔培养板(100/ml/孔)，随机分组处理，两次温热作用间隔分别为0h、4h、8h、16h、24h，接种后10天(中间换液一次)，计算克隆形成率(细胞数/克隆＞50个)。
1.4.2生长曲线：细胞接种于小培养瓶(2×105/瓶)，随机分组处理，两次温热作用间隔为8h，接种后，每日每组取3瓶(每瓶计数4次)计每毫升细胞数，连续计数6天，绘制生长曲线。
1.4.3Hsp70免疫组化染色：细胞接种于盖片上，随机分组处理，并于上述对应时间取出；固定后，一抗(Hsp70多抗，1∶500，日本扎幌医科大学病理实验室赠送)4℃孵育过夜，二抗(羊抗兔，1∶200)室温孵育30分钟，ABC复合物孵育30分钟，DAB(diaminobenzidine)显色，显微镜观察，并用MPVⅢ显微分光度计扫描法(波长490nm)测定细胞的透光度，计算消光值代表Hsp70的相对含量，每标本随机取20个细胞。
1.4.4WesternBlotting测定Hsp70〔3〕：接种细胞数600万/瓶，随机分组处理后即刻、8h，制备细胞裂解液；进行常规SDS－PAGE电泳(3％浓缩胶，10％分离胶)；分离胶半干转膜后，硝酸纤维素膜于5％Milk阻断液中阻断，一抗(Hsp70多抗，1∶500)4℃孵育过夜，二抗(羊抗兔，碱性磷酸酶标记，1∶200)孵育30分钟，加碱性磷酸酶反应底物显色。
1.5统计方法
本实验数据统计均采用SAS(StasticalAnalysisSystem)软件方差分析处理
2结果
2.1细胞克隆形成率
如图1所示：吐温80、41℃作用后，细胞克隆形成率轻度下降；而43℃作用后明显下降。41℃作用后的不同时间43℃再作用，细胞克隆形成率高于43℃对照，有显著意义(P＜0.001，24h除外），其中以16h最高，即时次之，提示细胞对43℃作用形成较高的耐受性；吐温80合并41℃作用后不同时间43℃再作用，细胞的克隆形成率均低于对应41℃+43℃组，有显著意义（P〈0.01）,其中合并作用后即时最显著（P〈0.001）。
图1 吐温80合并41℃温热作用后不同时间43℃再作用对BGC－823细胞克隆形成率的影响
2.2细胞生长曲线
如图2所示：41℃作用对细胞生长趋势的抑制不明显，吐温80有轻度抑制，而43℃作用较显著。41℃作用后8h43℃再作用，细胞生长趋势明显高于43℃对照，细胞对43℃作用的耐受性增高；合并作用后8h43℃再作用，细胞的生长趋势明显低于41℃＋43℃(8h)组，与43℃组相近。
图2 吐温合并41℃作用后8h43℃再作用对BGC－823细胞生长曲线的影响
2.3免疫组化ABC法Hsp70染色及MPV-Ⅲ显微分光光度计测定
37℃条件下BGC－823细胞Hsp70染色较浅。41℃作用后即时，Hsp70的表达无明显变化(P＞005)；此后劂达逐渐增加，8h达到高峰(P＞0.05)(图3)。吐温80单独作用后细胞Hsp70的表达与37℃无明显差异(P＞0．05)。合并作用后不同时间，细胞Hsp70明显低于相应41℃对照(P＜0.01,0h除外)(图3、5)。
图3 41℃合并吐温80作用后不同时间BGC－823细胞HSP70的相对含量
图4 41℃温热作用后8h，BGC－823细胞Hsp70表达达到高峰，呈深棕色，以核内为主。(免疫组化ABC法染色，400×)
图5 合并作用后8h，BGC－823细胞Hsp70表达受到明显抑制，Hsp70染色较浅。(免疫组化ABC法染色，400×)
2.4WesternBlotting测定
WesternBlotting结果显示(图6)；各组在分子量70kd附近出现紫蓝色的蛋白带，为Hsp70。BGC－823细胞在常温下Hsp70表达较少；吐温80作用后及41℃作用后即时，Hsp70的表达无明显变化，但41℃诱导后8h，Hsp70表达明显增加；合并作用后即时、8h，Hsp70的表达较41℃组均明显减少。
图6 吐温80合并41℃温热作用后时间BGC－823细胞Hsp70的表达，A：37℃对照；B：吐温对照；C：吐温＋41℃(0h)；D：41℃(0h)；E：＋41℃(8h)；F：41℃(8h)
3讨论
热耐受性通常是指细胞或生物体在初次或持续续非杀伤性温热作用之后，能耐受更高温热作用(杀伤性)而存活的特性〔1，2〕。41℃及43℃作用分别作为非杀伤性、杀伤性温热作用，能较好地检测BGC－823细胞热耐受性的变化。
热休克蛋白家族中的Hsp70与细胞在温热作用中的自身保护、热损伤后的修复以及热耐受性的形成有密切关系，Hsp70的表达量直接决定热耐受性的程度〔4，5〕。但本实验克隆形成率和免疫组化结果提示：BGC－823细胞在41℃诱导后产生的热耐受性可分两部分，一为非hsp70依赖性细胞热耐受性，于温热作用后立即产生，与hsp70表达增加无关，持续时间较短；另一为hsp70依赖性细胞热耐受性，出现较前者迟，热耐受性的高低与hsp70表达量平行，持续时间较长。这可能与热耐受性的多因素参与有关。有研究表明：除Hsp70外，HSP家族的其它成员〔6，7〕和细胞膜〔2〕也参与热耐受性的产生。
本实验结果表明：吐温80合并41℃温热，对BGC－823细胞热耐受性的产生及Hsp70的表达有明显抑制作用；对非Hsp70依赖热耐受性的抑制也非常显著，这对连续性温热治疗将有重要意义。由于细胞膜通过改变其脂质构成、增加其稳定性，与HSP共同参与了热耐受性的形成〔2〕，而吐温80能协同温热影响膜的稳定性〔8〕，抑制Hsp70的表达，因此吐温80合并温热可通过对膜及Hsp70表达的影响抑制了热耐受性的形成。
Hsp70表达是细胞的应激反应之一〔1〕，细胞热应激反应的信号传递与膜蛋白激活有密切关系〔9〕，由此推测吐温80合并41℃温热对BGC－823细胞Hsp70表达的抑制，可能与其协同温热对细胞膜、膜蛋白的影响而改变细胞信号传递有关。此外，吐温80能增强温热对细胞质膜结构的影响，引起细胞膜通透性的改变而影响细胞内环境的稳定；而细胞内低pH对Hsp70的表达有一定抑制作用〔10〕，因此，合并作用抑制Hsp70表达可能与此也有关。综上所述，吐温80合并温热对肿瘤细胞杀伤、抑制效应的中心环节可能是两者合并对细胞质膜的协同作用。
基金项目：国家自然科学基金及上海市科技发展基金资助课题(编号39170825，BB03801)
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收稿日期：1997－12－26；修回日期：1998－03－03
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