抑癌基因p⁵³对人胃癌细胞系放射敏感性的作用

中华放射肿瘤学杂志 1999年第2期第8卷 论　著

作者：张珊文　肖卫群　吕有勇

单位：100034　北京医科大学临床肿瘤学院放射治疗科

关键词：p⁵³基因；细胞凋亡；放射敏感性；胃肿瘤；细胞株

　　【摘要】　目的　评价野生型抑癌基因(正常)p53对人胃癌细胞系放射敏感性的控制作用。方法　用流式细胞仪分析4Gy照射后8和24小时4种不同p53状态的人胃癌细胞系细胞周期分布和凋亡的反应。以4Gy细胞存活份数和10Gy照射后的肿瘤生长曲线比较4种细胞的放射敏感性。结果　照射4Gy后8小时和24小时的p53正常的BGC-823细胞出现强烈的G₁期阻滞（分别占原细胞总数的67.9%和61.1%），比无照射的该细胞G₁期比例有显著的增高（P＜0.05），并出现明显的预示凋亡的亚G₁峰(Sub-G₁)，凋亡细胞比例分别达13.0%和15.3%；同样条件下其他3种p53异常的细胞G₁期比例没有显著的变化（P＞0.05），都没有出现亚G₁峰，凋亡细胞比例均为0.0%。p53正常的BGC-823细胞4Gy的存活份数明显低于其它3种细胞（P＜0.05）；且细胞移植肿瘤10Gy照射后比其它3种的生长受到更明显抑制（P＜0.05）。结论　以上的结果证实了野生型p53基因促进了照射后肿瘤细胞的G₁期阻滞和凋亡，从而明显地提高肿瘤细胞的放射敏感性。

　　Role of p53 tumor suppressor gene in radiosensitivity of

　　human gastric carcinoma cell lines

　　ZHANG Shanwen, XIAO Weiqun, LU Youyong.

　　Department of Radiotherapy, School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To assess the role of p53 tumor suppressor gene ( wild-type p53 ) in radiosensitivity of human gastric carcinoma cell lines.　Methods　Cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry of four human gastric carcinoma cell lines with different p53 statuses at H 8 and H 24 following irradiation of 4Gy. Surviving fraction of the four cell lines after 4 Gy irradiation was counted. Relative volume of implanted tumor of the four cell lines in nude mice was observed after irradiation of 10Gy.　Results　The BGC-823 cells (wtp53) containing normal p53 showed strong arrest in G₁ phase at H 8 and H 24 following 4 Gy irradiation (67.9% and 61.1% of original population) while the other three cell lines contained unnormal p53 had no arrest in G₁ in H 8 and H 24 following irradiation at 4Gy. In the BGC-823 cells (wtp53), a sub- G₁ peak of apoptosis was observed at H 8 and H 24 after 4 Gy irradiation, apoptotic cell rate 13.0% and 15.3% respectively. The other three cell lines gave no apoptotic response at H 8 and H 24 following 4 Gy irradiation.Surviving fraction of BGC-823 cells (wtp53) radiated at 4Gy significantly smaller than other three cell lines' (P＜0.05). Tumor of BGC-823 cells (wtp53) after 10 Gy irradiation was significantly was inhibited than the other three cell lines (P＜0.05).　Conclusions　 These results suggest that wild-type p53 promotes G₁ phase arrest and apoptosis of tumor cells following irradiation and,therefore, enhances intrinsic radiosensitivity of tumor cells.

　　【Key words】　p53 gene 　　Apoptosis　　Radiosensitivity　　Stomach neoplasms;cell lines

　　能引起细胞DNA损伤的放射线、细胞毒药物和热都可引发细胞周期的阻滞和凋亡,最终导致细胞死亡^［1-3］。细胞凋亡(apoptosis)又称程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD),是在基因调控下,通过主动的生化过程而自杀死亡的现象。放射线引起细胞周期G₁期阻滞和凋亡效应也受基因调控,癌基因和抑癌基因在肿瘤的放射凋亡效应中起重要的调控作用。G₁期阻滞和凋亡的程度与细胞的放射敏感性有密切的正相关性。基因调控可能是细胞内在放射敏感性在分子水平上的基础之一。野生型抑癌基因p53(正常p53基因）参与放射线引起的细胞G₁期阻滞和凋亡,它可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G₁期以进行DNA修复,或启动细胞凋亡程序清除受损细胞。如果p53基因缺失或变异将会减弱甚至破坏这些放射效应^［4-7］。p53基因缺失和变异广泛存在于各种恶性肿瘤中,p53异常频率约占各种恶性肿瘤的50%左右。这是恶性肿瘤对放射治疗反应性降低和放射治疗后复发率高的内在原因之一。

　　运用流式细胞仪(FCM),测定DNA的含量,显示细胞周期分布和凋亡。在DNA直方图上,G₁峰的左侧出现亚2倍体细胞群峰,这种Sub-G₁峰的出现提示凋亡的存在^{［6，8，9］}。O'Connor等^［6］用一适宜的单剂量6.3Gy照射17种恶性淋巴瘤细胞，照射后16小时的细胞周期分布显示正常p53的细胞出现强烈的G₁期阻滞。Mcllwrath等^［7］用一适宜的单剂量2Gy照射12种人恶性肿瘤细胞，照射后24小时的细胞周期分析显示正常p53的细胞出现强烈的G₁期阻滞。Zhen等^［8］用4Gy照射p53状态不同的2种淋巴母细胞，用FCM法显示正常p53的细胞出现提示凋亡的Sub-G₁峰。以上研究人员都证实：照射后G₁期阻滞和凋亡明显的细胞放射敏感性高。通过p53状态与细胞周期阻滞和凋亡关系的研究以及p53状态与细胞放射敏感性关系的研究，以探明p53基因对肿瘤细胞内在放射敏感性的控制作用，为抑癌基因p53应用于放射治疗中带来了挑战性机会。

　　为了进一步确定p53基因对放射引起的细胞G₁期阻滞和凋亡的影响,以及对肿瘤细胞放射敏感性的控制作用，在本研究中,我们分析了照射后4种不同p53基因状态的人胃癌细胞系的细胞周期变化和凋亡,并评价了这4种细胞照射后存活份数和照射后肿瘤抑制率，以进一步确定野生型p53提高肿瘤细胞放射敏感性的作用，为进一步展开野生型p53基因用于提高放射敏感性的研究提供可靠的实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系:通过脂质体介导将构建有野生型p53基因、突变型p53基因及无p53的空载质粒转染到有p53基因缺陷的人胃癌细胞BGC-823中,其中转染野生型p53为BGC-823-wtp53细胞（略写为wtp53）,转染突变型p53为BGC-823-mutp53细胞（略写为mutp53）,转染无p53空载质粒为BGC-823-vect细胞（略写为vectp53），亲本无转染人胃癌BGC-823细胞（略写为BGC-823）则作为对照细胞用于本实验中。北京市肿瘤分子生物学实验室构建出以上4种细胞系始终应用于本实验中，他们用PCR扩增等方法鉴定了以上3种外源p53基因已经转染到有p53基因缺陷的人胃癌BGC-823细胞中^［10］。

　　1.2　细胞培养:全部细胞均培养于含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM(Gibco)中,并置于含5%CO₂气体的37 ℃恒温孵育箱中。

　　1.3　流式细胞分析:无照射和照射4Gy的细胞在CO₂孵育箱中分别放置0，8，24小时后离心收获细胞,PBS溶液洗2遍,用75%乙醇(5 mL)固定，细胞浓度为1×10⁶/mL,于4 ℃下过夜。测试前用冰PBS溶液洗2遍,用37 ℃核糖核酸酶(Rnase) 100μg/mL处理1小时,再用碘化丙啶(Propidium iodide，PI) 50μg/mL 染色DNA。使用Coulter-profilo Ⅱ(Coulter Co)型流式细胞仪,测定细胞DNA含量,所得资料输入电子计算机程序勾画出细胞周期分布的直方图,在G₀/G₁峰前出现独特的亚2倍体细胞群的Sub-G₁峰被确定为特异的伴DNA降解的凋亡细胞峰。每1次实验各组和各时间点均为2个培养皿,并重复实验2次以上。

　　1.4　细胞存活份数分析：接种1×10³细胞于直径(d)为35 mm培养皿中,置于CO₂孵育箱中,翌日用⁶⁰Co-γ线照射细胞,照射剂量为4Gy,无照射1×10²细胞组作为空白对照组，细胞在CO₂孵育箱中分别放置14天后染色，以肉眼可见的显微镜下≥50个细胞的克隆计数为存活细胞。以对照组的克隆形成率(存活细胞数/接种细胞数×100%)为贴盘率。以公式：存活份数＝照射组克隆形成率/对照组克隆形成率，计算4Gy照射后4种细胞的存活份数。每次实验每种细胞3个平皿，实验重复3遍。

　　1.5　移植肿瘤生长分析：选用雌性裸鼠，6周龄，20～25g体重，用于本实验。以上4种细胞的单细胞悬液0.2 mL（细胞数1×10⁶）分别注射于裸鼠右下肢皮下。连续观察肿瘤形成和生长。用游标卡尺量取瘤体2个直径，以公式：

肿瘤体积＝π/6［（d₁＋d₂）/2］³

　　计算肿瘤体积。移植肿瘤直径长至7～10 mm时，在苯巴比妥麻醉下，⁶⁰Co-γ线局部照射肿瘤,照射剂量为10Gy，以观察天数为横坐标，以照射当日肿瘤体积为1，以肿瘤体积增加的倍数为纵坐标，绘制肿瘤照射后生长曲线。每次实验每种细胞接种裸鼠4只，并重复实验3次。

　　2　结果

　　2.1　无照射后8小时或24小时和4Gy剂量照射后0小时的4种细胞周期分布和凋亡的直方图显示：4种细胞的G₀/G₁，S和G₂/M期峰相似，G₀/G₁峰前都没有出现Sub-G₁峰。4种细胞无照射8小时后的细胞周期分布和凋亡的直方图显示：G₀/G₁，S和G₂/M期峰都相似，G₀/G₁峰前都没有出现Sub-G₁峰。4Gy剂量照射后8小时3种细胞，即mutp53细胞、vectp53细胞和BGC-823细胞的细胞周期分布和凋亡的直方图与无照射8小时后的相似，而且G₀/G₁峰前都没有出现Sub-G₁峰。只有4Gy剂量照射后8小时wtp53细胞G₀/G₁期峰明显增大和在G₀/G₁峰前出现Sub-G₁峰，提示凋亡细胞存在。4Gy剂量照射后24小时4种细胞周期分布和凋亡的直方图也和8小时结果一样，只显示wtp53细胞G₀/G₁期峰明显增大和在G₀/G₁峰前出现Sub-G₁峰，提示凋亡细胞存在。

　　4种细胞系无照射和4Gy剂量照射0，8，24小时后细胞周期分布比例和凋亡细胞比例的结果表明：4种细胞无照射后0，8，24小时和4Gy剂量照射后0小时的G₀/G₁，S，G₂/M期比例差异无显著意义(P＜0.05)，凋亡细胞比例均为0.0%。仅有wtp53细胞在4Gy剂量照射后8，24小时细胞周期分布比例出现明显变化,表现在G₂/M期比例明显减少(P＜0.05),G₁期比例明显增加(P＜0.05),分别占原细胞总数的67.9%和61.1%，也比同样照射条件下其它3种细胞G₁期比例明显增加(P＜0.05),并出现明显的凋亡效应，凋亡细胞比例分别达13.0%和15.3%。而其他3种细胞在同样的照射条件下G₁期比例无明显变化,凋亡细胞比例均为0.0%。

　　2.2　wtp53细胞、mutp53细胞、vectp53细胞和BGC-823细胞的4Gy存活份数分别为0.108±0.006，0.155±0.004，0.147±0.007和0.140±0.013。wtp53细胞的存活份数显著地低于后3种细胞(P＜0.05)，后3种细胞的存活份数之间差异无显著意义(P＞0.05)。

　　2.3　4种细胞移植肿瘤照射10Gy后肿瘤生长曲线（如图1）显示：wtp53细胞移植肿瘤在照射后第2天肿瘤体积缩小0.3倍，随后缓慢增长，至第12天仅增大0.5倍；其它3种细胞移植肿瘤照射后都明显增大，至第12天增大了4～5倍，生长速度明显高于wtp53细胞(P＜0.05)，后3种细胞的生长速度之间差异无显著意义(P＞0.05)。

图1　10Gy照射后4种不同p53状态人胃癌细胞移植肿瘤生长曲线

　　3　讨论

　　实验结果证明：具有正常p53功能的wtp53细胞在4Gy剂量照射后8和24小时G₁期比例明显增加，即出现明显的G₁期阻滞（分别占原细胞总数的67.9%和61.1%)和出现细胞凋亡效应，细胞凋亡比例分别达13.0%和15.3%。而p53基因变异或缺失的mutp53细胞、vectp53细胞和BGC-823细胞在同样的条件下G₁期比例无明显变化,凋亡细胞比例均为0。4Gy照射wtp53细胞存活份数明显低于其它3种细胞，10Gy照射后wtp53细胞的移植肿瘤生长抑制比其它3种细胞肿瘤更明显，它们说明野生型p53细胞放射敏感性明显高于其它3种p53基因变异或缺失的细胞。本组实验的结果与国外学者的研究结果相同^{［5-7，9］}。本实验结果充分说明：正常p53基因明显促进放射引起的细胞G₁期阻滞和凋亡效应，p53功能变异或缺失将会减弱甚至破坏这些放射效应。野生型p53是通过促进放射引起的细胞G₁期阻滞和凋亡效应来提高细胞放射敏感性的。如果p53功能异常的肿瘤细胞导入野生型p53后放射敏感性将会明显提高，放射线对肿瘤的局部控制也会明显提高。本研究的结果为下一步展开野生型p53用于提高放射治疗疗效的基因治疗研究提供了依据。

　　国家自然科学基金资助课题(编号：39670234)

　　 参考文献

　　[1]　Lee JM,Bernstein A. Apoptosis,cancer and the p53 tumor suppressor gene. Cancer Metast Rev,1995，14:149-161.

　　[2]　Lotem J, Sachs L. Hematopoietic cells from mice deficient in wild-type p53 are more resistant to induction of apoptosis by some agents. Blood, 1993,82:1092-1096.

　　[3]　Zhu WG, Aramaki R, Cai Y, et al. Promotion of heat-induced apoptosis in FM3A cells by protease inhibitors. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 225:924-931.

　　[4]　Ling CC, Endlich B. Radioresistance induced by oncogenic transformation. Radiat Res, 1989, 120: 267-279.

　　[5]　Lowe SW, Bodis S, Mcclatchey A, et al. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science, 1994,266:807-810.

　　[6]　O'Connor PM,Jackman J, Joniel D, et al. Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines. Cancer Res, 1993, 53: 4776-4780.

　　[7]　Mcllwrath AJ, Vasey PA, Ross GM, et al. Cell cycle arrests and radiosensitivity of human tumor cell lines: dependence on wild-type p53 for radiosensitivity. Cancer Res, 1994, 54: 3718-3722.

　　[8]　孙梅，吕有勇. 外源性p53 基因对人胃癌细胞恶性增殖的影响.科学通报，1996，41：825-828.

　　[9]　Zhen W, Denault CM, Loviscek K, et al. The ralative radiosensitivity of TK6 and WI-L2-NS lymphoblastoid cells derived from a common source is primarily determined by their p53 mutational status. Mutat Res, 1995, 346:85-92.

　　[10]　Hong S, Wang YC. Apoptosis of human leukemic HL-60 cells induced to diffe- rentiate by treatment with RA or DMSO. Cell Res, 1995，5:181-186.