增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应
中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 基础研究
作者：戴林 张学庸 惠宏襄 王成济 樊代明
单位：116021 大连，解放军第二一○医院(戴林)；西安第四军医大学西京医院(张学庸、樊代明)，分子生物学教研室(惠宏襄、王成济)
关键词： 胃肿瘤 细胞株 增殖细胞核抗原 RNA，反义 基因治疗
【摘要】 目的 观察增殖细胞核抗原(PCNA)基因反义RNA表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法 用DNA重组方法将人PCNA基因反向克隆到真核表达质粒pDOR-neo中，构建成人PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA,用脂质体介导转染人胃癌细胞系SGC-7901。结果 经G418筛选获得转染细胞SGC/PCNA，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，RNA、蛋白质的生物合成受到抑制，S期、G2/M期DNA含量降低。结论 PCNA基因反义RNA对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。
Construction of PCNA antisense RNA expression vector and its antitumorigenic effect on human gastric cancer cell Dai Lin, Zhang Xueyong, Hui Hongxiang, et al. Department of Gastroenterology, 210 Hospital of PLA, Dalian 116021
【Abstract】 Objective To observe the effect of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) antisense RNA on the growth characteristics of human gastric cancer cell. Methods An eukaryotic expression vector pDR-PCNA with human PCNA gene insert in reverse direction was successfully constructed. The human gastric cancer cell line SGC-7901 was transfected with pDR-PCNA by lipofectamineTM. Results Growth rate, protein and RNA biosynthesis and DNA contents in S-phase and G2/M-phase of the transfected SGC-7901 were significantly suppressed in comparison with those of the parental cell line. Conclusion PCNA antisense RNA can significantly suppress the in vitro growth of gastric cancer cell line.
【Subject words】 Stomach neoplasms Cell line Proliferating cell nuclear antigen RNA, antisense Gene therapy
增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear ant- igen, PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。PCNA在许多肿瘤组织中都有高表达［1］，并随肿瘤浸润深度增加及转移，其表达呈明显上升趋势［2］。Sakakura等［3］用18-mer PCNA反义ODN抑制了多种胃癌细胞系的生长。提示PCNA与肿瘤发生、发展关系密切，有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。为研究PCNA基因与胃癌的关系，探索胃癌基因治疗的靶基因，我们构建了人PCNA基因反义RNA真核表达质粒，并观察其对人胃癌细胞的抑瘤效应。
材料与方法
1.基因与载体：pT7hPCNA质粒由美国冷泉港分子生物学实验室Waga博士惠赠，在其表达载体p30382XT的XbaI、BamHI位点间插有人PCNA基因。真核细胞表达质粒pDOR-neo由英国皇家癌症研究会Morgenstern博士惠赠。
2.主要试剂：Lipofect amineTM脂质体药盒购自Gibco公司，G418购自Sigma公司，［α-32p］UTP购自北京福瑞公司，限制性内切酶、连接酶购自华美生物技术有限公司。
3.质粒制备：DNA片段回收、DNA连接、细菌转化及基因鉴定参照《分子克隆实验指南》［4］进行。
4.DNA转染：用Lipofect AMINETM介导将空载质粒pDOR-neo及重组质粒pDR-PCNA转染至人胃癌细胞SGC-7901(由军事医学科学院毒物药物研究所引入)，分别命名为SGC/neo和SGC/PCNA，并以SGC-7901作为阴性对照。转染72小时后，用G418(400 μg/ml)筛选3周，挑取单个抗性细胞在G418(100 μg/ml)下常规培养扩增。
5.细胞生长曲线：在24孔培养板中，分别于每孔接种每毫升3×104个细胞，每日取各种克隆细胞株3孔，0.25%胰酶消化计数，连续5天，绘制出生长曲线。
6.RNA单链探针的制备及RNA斑点杂交：将PCNA基因头尾端克隆至pEG3Z质粒的HindⅢ和BamHI位点间，分别利用SP6、T7启动子体外转录盒(Riboprobe Kit,美国promega公司)，及［α-32p］UTP标记出正义和反义PCNA RNA单链探针。提取SGC-7901和经转染72小时后的SGC/PCNA细胞RNA，按常规方法进行RNA斑点杂交。
7.免疫组织化学染色及图像分析：取经转染72小时的3组细胞爬片，经冷丙酮固定后，进行ABC免疫组化染色，观察PCNA表达的变化，同时进行图像分析。
8.细胞周期测定：取1×106对数生长期单细胞悬液，0.01 mol/L pH7.4 PBS洗涤后，70%乙醇固定，PI(propidium iodide)染色，应用Partec-CAⅡ型流式细胞仪(FCM)检测细胞DNA含量。
9.透射电镜观察：SGC/PCNA、SGC/neo和SGC-7901 3种细胞各取1×106，经0.01 mol/L pH7.4 PBS洗涤后，加入6%小牛血清白蛋白，粘合反应30分钟，离心弃上清，25%戊二醛4℃固定24小时，按常规电镜制作技术制备电镜标本，600～800 nm的超薄切片收集于带膜的铜网上，经铀、铅电子染色后，行电镜(JEM-2000EX)观察。
结果
1.PCNA反义RNA表达质粒的构建及鉴定：用BamHI和XbaI酶切质粒pT7hPCNA，得到1.3kb人PCNAcDNA全长序列，将其插入到pUC19质粒Bam HI～XbaⅠ间，成为pUC-PCNA，再分别用PstI、EcoR I、Kpn I和Sal I-BamHI进行酶切分析，得到大小不同的片段。这些片段与PCNAcDNA序列一致。回收SalI-BamHI片段并将其反向(定向克隆)插入到pDOR-neo(6.5kb)的BamHI-SalI位点间，经连接、转化和酶切，鉴定筛选出重组质粒(图1)，并将其命名为pDR-PCNA。
2.细胞生长曲线：SGC/PCNA细胞经G418筛选后，其生长速度与亲本细胞SGC-7901相比明显减慢，在培养第5天，细胞生长抑制达59%。而SGC/neo细胞生长速度与亲本细胞相比，无明显改变(图2)。
3.细胞内mRNA水平变化：PCNA正义RNA单链探针检测到SGC/PCNA细胞有较强的杂交信号，
1：pDR-PCNA经SalI-BamHI酶切 2：λDNA/HindⅢ DNA分子量标准 3：pDR-PCNA质粒
图1 重组质粒pDR-PCNA酶切电泳分析
图2 细胞生长曲线
而SGC-7901细胞无杂交信号产生。表明pDR-PCNA已整合至SGC-7901细胞染色体中，并有较高浓度的PCNA反义RNA表达(图3a)。反义PCNA RNA单链探针检测到SGC-7901细胞有强杂交信号，而SGC/PCNA细胞也有杂交信号出现，但较SGC-7901细胞明显减弱，表明SGC/PCNA细胞正义PCNA mRNA的表达被部分抑制(图3b)。经对杂交斑点薄层扫描(CX-9000薄层扫描仪，日本岛津)，SGC/PCNA细胞PCNA mRNA被抑制47.5%。
A：PCNA正义RNA探针检测反义RNA B：PCNA反义RNA探针检测正义RNA 1：SGC/PCNA 2：SGC-7901
图3 RNA斑点杂交
4.免疫组化染色：免疫组化染色显示，SGC/PCNA细胞体积缩小，阳性细胞所占比例及染色深度较SGC-7901细胞明显降低，而SGC/neo与SGC-7901大体相同。用图像分析法对每张染片5个高倍视野中124个阳性细胞灰度、面积进行测定，结果显示两组差异有非常显著性(P＜0.0001)。
5.转染细胞的周期分布：FCM分析显示，SGC/PCNA细胞与SGC-7901相比，G1期细胞增加20.5%，而S期和G2/M期细胞分别减少29.8%和21.2%。SGC/neo与SGC-7901细胞相比无明显变化(附表)。
附表 FCM测定细胞周期分布
| 组别 |
DNA含量(%) |
| G0/G1 |
S |
G2+M |
| SGC-7901 |
57.1 |
32.6 |
10.4 |
| SGC/neo |
48.1 |
30.8 |
21.1 |
| SGC/PCNA |
68.8 |
23.0 |
8.2 |
6.转染细胞超微结构变化：透射电镜观察SGC-7901和SGC/neo细胞形态正常，核仁、染色体及细胞器清晰可见，核膜包膜完整。而SGC/PCNA细胞形态出现多种改变，不仅有空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀，而且部分细胞出现核染色质浓集成块，在核膜下边集，呈月牙状。
讨论
胃癌的发生机制十分复杂，不仅涉及多种癌基因、抑癌基因的变化，而且一些细胞因子在胃癌的发生发展中也起到一定的作用。尽管这些基因、细胞因子对细胞的作用方式不同，作用途径和作用部位有别，但最终结果都将导致细胞的恶性增殖。因此，遏制细胞的恶性增殖是肿瘤治疗的基础。
PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子，不仅在DNA复制中起到关键作用，而且来自细胞内外的增殖信号都须经过PCNA的参与，才能引发DNA的合成。众多研究表明，PCNA在几乎所有肿瘤组织中都有高表达［5，6］，我们免疫组化研究也表明，PCNA在胃癌的阳性表达率为100%，并与胃癌淋巴结转移密切相关［7］。为此，我们选择PCNA作为胃癌基因治疗的靶位，用真核细胞质粒载体表达的PCNA反义RNA特异性封闭肿瘤细胞的mRNA,以期控制癌细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。实验结果表明，当pDR-PCNA转染胃癌细胞后，反义RNA单链探针检测到SGC/PCNA细胞内PCNA正义RNA水平降低47.5%；转染细胞的免疫组化染色强度明显降低，阳性细胞所占比例下降；SGC/PCNA生长速度明显减慢，G1期DNA含量增多，而S期、G2/M期含量降低。这些变化主要是由于PCNA被抑制后，细胞内DNA合成减少，致使癌细胞增殖受阻。此外，SGC/PCNA细胞超微结构发生了变化，如空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀等，部分细胞出现胞浆固缩和染色质浓缩边集等改变。这种变化是否与细胞凋亡有关，还有待进一步证实。有关PCNA与凋亡的关系尚未见报道，但这一现象的出现，为我们更深入了解PCNA的作用及细胞调控机制提供了一种参考数据。
上述结果提示，用PCNA基因反义RNA阻断其特定的基因表达，可以抑制SGC/7901胃癌细胞的增殖，改变肿瘤细胞的生物学行为。合理地利用反义技术以改变和逆转肿瘤细胞的恶性表型，是肿瘤基因治疗的一个方向。
参考文献
1Robbins BA, Vega D, Ogata K, et al. Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen in solid human malignancies. Arch Pathol Lab Med, 1987, 111:841-845.
2Maeda K, Chung YS, Onoda N, et al. Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative biopsy specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis. Cancer, 1994, 73: 528-533.
3Sakakura C, Hagiwara A, Tsujimoto K, et al. Inhibition of gastric cancer cell proliferation by antisense oligonucleotides targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen. Br J Cancer, 1994, 70: 1060-1066.
4J萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯(金冬雁，黎孟枫等译). 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学出版社，1992.
5Wiethege T, Voss B, Muller KM. p53 accumulation and proliferating cell nuclear antigen expression in human lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol, 1995, 121: 371-377.
6Taniai M, Tomimatsu M, Okuda H. Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen in hepatocellular carcinoma relationship to histological grade. J Gastrenterol Hepatol, 1993, 8: 420-425.
7戴林，张学庸，陈宝军，等. 增殖细胞核抗原与胃癌淋巴结转移的关系. 第四军医大学学报，1996，17： 169-171.
(收稿：1998-01-14 修回：1998-02-27)
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