婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戝鈧倿鎸婃竟鈺嬬秮瀹曘劑寮堕幋鐙呯幢闂備浇顫夊畷妯衡枖濞戞碍顐介柕鍫濇啒閺冨牊鏅查柛娑卞幗濞堟煡姊虹粙娆惧剰妞ゆ垵顦靛濠氭晲閸涘倻鍠庨埢搴ㄥ箚瑜庨鍕煛婢跺棙娅嗙紒璇茬墕椤繘鎼圭憴鍕/闂侀潧枪閸庢煡鎮甸姀銈嗏拺闁荤喐婢樺▓鈺呮煙閸戙倖瀚� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌ら崫銉︽毄濞寸姵纰嶆穱濠囨倷椤忓嫧鍋撻弽顓炲瀭闁汇垻枪缁犵娀鏌熼悧鍫熺凡缂佺姵鐓¢弻鏇$疀鐎n亖鍋撻弴鐘典笉闁挎繂顦伴悡銉╂煛閸ヮ煈娈斿ù婊堢畺濮婃椽鎸婃径濠冩闂佸摜濮甸悧鐘差嚕婵犳艾惟闁冲搫鍊告禍鐐烘⒑缁嬫寧婀扮紒瀣灴椤㈡棃鏁撻敓锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌ら崫銉︽毄濞寸姵姘ㄧ槐鎾诲磼濞嗘帒鍘$紓渚囧櫘閸ㄥ爼濡撮崘顔煎窛閻庢稒锚娴犲ジ姊虹紒妯虹伇濠殿喓鍊濆畷鎴﹀Ω瑜忕壕濂告倵閿濆骸浜滄い鏇熺矒閺岋絾鎯旈鐓庘拫濠殿喖锕ㄥ▍锝夊箲閸曨垰惟闁靛濡囪ぐ姘舵⒒娴g儤鍤€闁搞倖鐗犻獮蹇涙晸閿燂拷 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾圭€瑰嫭鍣磋ぐ鎺戠倞闁靛ě鍛獎闂備礁澹婇崑鍛村箚婵犲倵妲堥柕蹇曞Х椤︽澘顪冮妶鍡欏ⅳ闁稿鎹囬弻娑㈠Ψ椤旂厧顫╃紓浣插亾闁告劦鍠楅悡鐘电棯閺夊灝鑸瑰褜鍨辩换娑㈠醇濠靛嫬浠┑顔硷龚濞咃綁骞戦崟顖毼╅柕澶涘瑜版岸姊绘担鐑樺殌闁搞倖鐗犻獮蹇涙晸閿燂拷 缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾剧懓顪冪€n亝鎹i柣顓炴閵嗘帒顫濋敐鍛闂備浇顕栭崹浼此囬悽绋跨疇闁哄稁鍘奸悡娑㈡煕鐏炴崘澹樼紒銊e劜缁绘繈鎮介棃娑掓瀰濠电偘鍖犻崶銊ヤ罕闂婎偄娲﹀ú婊堟儗閸℃せ鏀介柣妯哄级婢跺嫰鏌i幘鍗炲姦闁哄矉缍佸鎾倷濞村浜鹃柛锔诲幐閸嬫挸顫濋悙顒€顏� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋為悧鐘汇€侀弴銏℃櫇闁逞屽墰婢规洟鎮烽幍铏杸闂佺粯锚閻ゅ洦绔熷Ο鑲╃<闁绘﹢娼ч埢鍫ユ煛瀹€鈧崰鏍嵁閸℃凹妲鹃梺鍦櫕婵數鎹㈠☉銏犲窛妞ゆ牗鍩冮弸鍛存⒑閸濆嫯顫﹂柛鏃€鍨块獮鍐Χ婢跺﹦锛滃┑鐐村灦閿曗晜瀵奸敓锟� 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧鏌i幇顒佹儓闁搞劌鍊块幃瑙勬姜閹殿喚协濠电偞鍨崹鍦不閿濆鐓熼柟閭﹀幖椤ュ绱掗悩鍐插摵婵﹥妞介獮鏍倷閹绘帒肖闂備礁鎲¢幐璇茬暆缁嬭法鏆﹂柡鍥ュ灩缁犺崵绱撴担璐細闁告瑥妫濆铏圭磼濡崵顦ラ梺绋匡工濠€閬嶅焵椤掍胶鍟查柟鍑ゆ嫹 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧鏌i幇顒佹儓闁搞劌鍊块弻娑㈩敃閿濆棛顦ョ紓浣哄Т缂嶅﹪寮诲澶婁紶闁告洦鍓欏▍锝夋⒑濞茶骞楁い銊ワ躬瀵顓奸崼顐n€囬梻浣告啞閹稿鎯勯鐐叉槬闁逞屽墯閵囧嫰骞掗幋婵囩亾濠电偛鍚嬮崝娆撳蓟閻斿搫鏋堥柛妤冨仒閸犲﹤螖閻橀潧浠滅紒缁橈耿瀵偊骞樼紒妯绘闂佽法鍣﹂幏锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹瀹勬噴褰掑炊瑜忛弳锕傛煟閵忊懚鍦玻濡ゅ懏鐓欓柟娈垮枛椤eジ鏌涚€e墎绡€闁哄本娲樺鍕醇濠靛棗顥欐繝鐢靛仦閸ㄦ儼褰滈梺琛″亾濞寸姴顑嗛崐鐢告煥濠靛棗鏆欏┑锛勫厴閺屾稓鈧綆鍋呭畷宀€鈧娲樼敮锟犲箖濞嗘垟鍋撳☉娅虫垿顢旈悢鍏尖拻濞达綀濮ょ涵鍫曟煕閿濆繒鐣垫鐐茬箻閺佹捇鏁撻敓锟�

婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧鏌i幇顒佹儓闁搞劌鍊块弻娑㈩敃閿濆棛顦ョ紓浣哄Т缂嶅﹪寮诲澶婁紶闁告洦鍓欏▍锝夋⒑缁嬭儻顫﹂柛鏃€鍨垮濠氬Χ閸氥倕婀遍埀顒婄秵閸嬪懘鎮甸幒妤佲拺缂備焦锚缁楁帡鏌ㄩ弴銊ら偗鐎殿喖顭烽弫鎰板川閸屾稒顥堥柛鈹惧亾濡炪倖甯掔€氼參宕戠€n喚鍙撻柛銉e妿閳藉鏌i幘瀵哥疄闁哄矉绻濆畷鍫曞Ψ閵壯傜棯闂備胶绮幐鍫曞磿閻㈢ǹ钃熼柨鐔哄Т绾惧吋鎱ㄥΟ鍝勭秮闁惧繐閰e娲箮閼恒儲鏆犲┑顔硷工濠€閬嶅箲閵忕姭妲堟慨姗嗗幖閸樺綊姊绘担鍝ヤ虎妞ゆ垵鎳橀、鏃堟晸閿燂拷 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧鏌i幇顒佹儓闁搞劌鍊块弻娑㈩敃閿濆棛顦ョ紓浣哄Т缂嶅﹪寮诲澶婁紶闁告洦鍓欏▍锝夋⒑缁嬭儻顫﹂柛鏃€鍨垮濠氬Χ閸氥倕婀遍埀顒婄秵閸嬪懘鎮甸幒妤佲拺缂備焦锚缁楁帡鏌ㄩ弴妯衡偓婵嗭耿娓氣偓濮婅櫣绮欑捄銊ь唶闂佸憡鑹鹃鍥╂閻愬搫绠i柣鎰缁犳艾顪冮妶鍡楀Ё缂佹彃婀辩槐鎾愁潩閼哥數鍘甸梺鍛婄懃椤︿即宕愰幇鐗堢厵妞ゆ柣鍔屽ú銈夋煁閸ャ劎绡€闂傚牊绋撴晶銏ゆ煙閾忣偆澧垫慨濠勭帛閹峰懘鎸婃径妯活棈婵$偑鍊栧ú妯煎垝閹捐崵宓侀煫鍥ㄧ⊕閺呮悂鏌ㄩ悤鍌涘 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧鏌i幇顒佹儓闁搞劌鍊块弻娑㈩敃閿濆棛顦ョ紓浣哄Т缂嶅﹪寮诲澶婁紶闁告洦鍓欏▍锝夋⒑濞茶骞楁い銊ワ躬瀵顓奸崼顐n€囬梻浣告啞閹稿鎯勯鐐叉槬闁逞屽墯閵囧嫰骞掗幋婵囩亾濠电偛鍚嬮崝娆撳蓟閻旂厧宸濆┑鐘插暙閳ь剚鍔楅埀顒冾潐濞叉﹢宕濆▎蹇曟殾鐟滅増甯╅弫瀣煕濞戝崬骞楁い鎾村娣囧﹪鎮欓鍕ㄥ亾閺嶎偅鏆滈柟鐑樻煛閸嬫挸顫濋悡搴$睄閻庤娲橀崹鍧楀极閹剧粯鍋愮€规洖娲ら獮鎰攽閻橆喖鐏辨繛澶嬬洴椤㈡牠骞囬弶璺紵闂侀潧顦弲婊堟偂濞戙垺鐓曢柍钘夋楠炴鎮楀鐐
缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾剧懓顪冪€n亝鎹i柣顓炴閵嗘帒顫濋敐鍛闂佽姤蓱缁诲牓寮婚悢椋庢殝闁绘鐗婇幏閬嶆⒑閻熸澘鏆遍柣顓炲€搁~蹇曠磼濡顎撻梺鍛婄☉閿曘儵宕曢幘缁樷拺婵炶尪顕ф晶顕€鏌曢崼鈶跺綊鎮鹃柨瀣嚤闁哄鍨甸崬銊╂偡濠婂嫮鐭掔€规洜鏁诲鎾閿涘嫬骞堝┑鐘垫暩婵鈧凹鍓熷鎼佸籍閸喓鍘介梺闈涚墕閸婂憡绂嶆ィ鍐┾拻闁稿本鐟чˇ锕傛煙绾板崬浜滈悡銈夋煏婵炵偓娅呯紒鎰殜閺岀喖宕滆鐢盯鏌涚€n偓鑰块柡灞炬礃瀵板嫰宕卞Ο鑽ゅ絾闂備焦濞婇弨閬嶅垂閸ф钃熼柣鏃囨閻瑩鏌涜椤ㄥ繘鍩€椤掍緡娈滈柡灞剧洴閹晠鎼归銈庢Ч闂備礁鎼惉濂稿窗閺嵮呮殾婵炲棙鎸稿洿闂佺硶鍓濋〃蹇斿閿燂拷 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋涢ˇ鐢稿极閹剧粯鍋愰柤纰卞墻濡茬兘姊绘担鍛婃儓婵炲眰鍨藉畷褰掑捶椤撶姳绗夐梺缁樶缚缁垶鎮″▎鎾寸厸濠㈣泛锕︽禒銏㈢磼閵娿劌鍚圭紒杈ㄦ尭椤撳ジ宕卞▎蹇婃嫲闂備礁鎼悮顐﹀礉閹达箑绠栭柕鍫濐槸绾惧吋绻涢幋鐑囦緵濞寸》鎷� 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繐霉閸忓吋缍戦柛銊ュ€搁埞鎴﹀磼濠ф挸缍婂浼村Ψ閳哄倻鍘搁悗骞垮劚妤犳悂鐛Δ鍛厱閻庯綆浜堕崕鎰磼缂佹ḿ绠栫紒缁樼箞瀹曟帒饪伴崘锝嗗缂傚倸鍊搁崐鍝ョ矓閻㈠憡鍋嬮柣妯款嚙閽冪喖鏌曟繛鐐珕闁稿妫濋弻娑氫沪閸撗€妲堝銈呴獜閹凤拷 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柛娑橈攻閸欏繘鏌i幋婵愭綗闁逞屽墮閸婂湱绮嬮幒鏂哄亾閿濆簼绨介柛鏃撶畱椤啴濡堕崱妤冪懆闂佸摜鍣ラ崹鍫曞箖閻㈠壊鏁傞柛鈥崇箰娴滈箖鏌i悢鍝勵暭闁哥喓鍋熺槐鎺旀嫚閹绘帗娈绘繝纰夌磿閺佽鐣烽悢纰辨晬闁挎繂妫欏▍鍥ㄤ繆閻愵亜鈧牜鏁繝鍕焼濞撴埃鍋撴い銏℃閺佹捇鏁撻敓锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸婂潡鏌ㄩ弴鐐测偓褰掑磿閹寸姵鍠愰柣妤€鐗嗙粭鎺楁煕閵娿儱鈧悂婀侀梺缁樓圭亸娆撳箠娴e壊鐔嗛柤鎼佹涧婵洨绱掗悩渚殭闂囧鏌涜箛姘汗闁瑰啿鎳愮槐鎺斺偓锝庝簽缁犵粯鎱ㄦ繝鍛仩闁圭懓瀚版俊鎼佸Ψ閿旀儳缍掗梻鍌欒兌閹虫捇宕甸弽顓炵闁跨噦鎷� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋涢ˇ鐢稿极閹剧粯鍋愰柛鎰紦閻㈠姊婚崒娆戣窗闁告挻鐟х划鏃傗偓闈涙憸娑撳秵銇勯弽顐沪闁绘挶鍎甸弻锝夊即閻愭祴鍋撻崷顓涘亾濮樼偓瀚� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋為〃鍛淬偑娴兼潙绀嬫い鎰╁灮娴滄牠姊绘担鍛婅础闁惧繐閰e畷浼村冀椤愩倓绗夊銈嗙墱閸嬬偤鎮¢妷鈺傜厽闁哄洨鍋涢埀顒€婀遍埀顒佺啲閹凤拷 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻㈠壊鏁婇柡宥庡幖缁愭淇婇妶鍌氫壕闂佷紮绲块崗妯虹暦瑜版帩鏁嬮柛娑卞幗閸婎垶姊绘担铏广€婇柛鎾寸箞閵嗗啳绠涢弬娆惧殼闂佽法鍣﹂幏锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸婂潡鏌ㄩ弴妤€浜惧銈庝簻閸熸挳鐛幇顓熷劅闁挎繂瀛╅柨銈夋⒒娴h櫣甯涢柛銊у帶铻為柛鏇ㄥ幘娑撳秵銇勯弽顐沪闁绘挶鍎甸弻锝夊即閻愭祴鍋撻崷顓涘亾濮樼偓瀚� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌涢锝嗙闁稿被鍔庨幉鍛婃償閵娿儳鐣鹃梺鍝勫€哥花閬嶅醇椤忓牊鐓曟い鎰剁悼缁犳ɑ銇勯弬鎸庮棦婵﹨娅i幑鍕Ω閵夛妇褰氶梻浣烘嚀閸ゆ牠骞忛敓锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌ら崫銉︽毄濞寸姵纰嶇换婵嗏枔閸喗鐏嶉梺鎸庢处閸嬪棛鍒掓繝姘闁挎洍鍋撻柣鎾寸箞閺岋繝宕橀妸褍顣洪梺鍛婎殙濞呮洟濡甸崟顖f晝妞ゆ劑鍨洪悘鎾剁磽娴e壊鍎忕紒缁樏~蹇涙惞鐟欏嫬纾梺闈浨归崕鏌ユ偟閵忋倖鈷戦柣鐔告緲濞堚晠鏌熼崙銈嗗 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾圭€瑰嫭鍣磋ぐ鎺戠倞闁靛ě鍛獎闂備礁澹婇崑鎺戭熆閳ь剟鏌i幒鎴敾缂佺粯鐩畷鍗炍熼崫鍕垫綌闂備礁鎲¢悷銉ф崲閹邦垳浜欓梻浣瑰缁诲倿骞婃惔銊ユ辈婵炲棙鍨瑰Λ顖炴煙椤栧棗瀚禒鎾⒑閸濆嫯顫﹂柛鏃€鍨块獮鍐Χ婢跺﹦锛滃┑鐐村灦閿曗晜瀵奸敓锟� 濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忛柣鎴f閺嬩線鏌熼梻瀵割槮缁惧墽绮换娑㈠箣閺冣偓閸ゅ秹鏌涢妷顔煎⒒闁轰礁绉归弻锝夊箛椤撶喓绋囧┑鐐茬墳缁蹭粙鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冪懃椤呯磽娓氬洤鏋涙繛鎾棑閸掓帡宕奸妷銉ь槹濡炪倖鐗楃粙鎾诲矗閸℃稒鈷戠紓浣股戠粈鈧梺绋匡工濠€閬嶅焵椤掍胶鍟查柟鍑ゆ嫹 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌涢锝嗙闁稿被鍔庨幉绋款吋婢舵ɑ鏅梺鎸庣箓椤︻垳绮堥崼婢濆綊鏁愰崶銊ユ畬闁瑰吋娼欓敃顏勵潖閾忕懓瀵查柡鍥╁仜閳峰绱撴担鍓插剱闁搞劏顫夌粩鐔煎即閵忕娀鏁滃┑掳鍊撻懗鍫曞矗閸℃稒鈷戠紓浣股戠粈鈧梺绋匡工濠€閬嶅焵椤掍胶鍟查柟鍑ゆ嫹 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌涢锝嗙闁稿被鍔庨幉绋款吋婢舵ɑ鏅梺鎸庣箓椤︻垳绮堥崼婢濆綊鏁愰崼鐕佷哗闂佺粯鎸婚幑鍥ь潖濞差亜浼犻柛鏇ㄥ幐閺嬪棝姊洪崨濞楀綊宕戦幇顓犵彾闁哄洨鍠撶弧鈧┑顔斤供閸橀箖宕i崱娑欌拺缂備焦蓱缁€鈧梺绋匡工濠€閬嶅焵椤掍胶鍟查柟鍑ゆ嫹 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閹绢喗鍎夊鑸靛姇缁狙囧箹鐎涙ɑ灏ù婊呭亾娣囧﹪濡堕崟顓炲闂佸憡鐟ョ换鎰版箒闂佺ǹ绻愰崥瀣礊閹寸姷纾奸柍褜鍓氬鍕箛椤掑偆鍟囬梻浣告贡閳峰牓宕㈡ィ鍐ㄥ偍婵犲﹤鎳愮壕鐣屸偓骞垮劚濡稒鏅堕悽鍛婄厸閻忕偠顕ф慨鍌炴煙椤斿搫鈧繂鐣烽幒鎴旀婵妫旂槐锟� 缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧湱鈧懓瀚伴崑濠傘€掓繝姘厵闁绘垶锕╁▓鏇㈡煕閵堝懎顏柡灞剧洴椤㈡洟鏁愰崱娆樻К缂備胶鍋撻崕鎶解€﹂悜钘夎摕闁挎繂顦Λ姗€鏌熺粙鍨劉闁稿孩鎹囧娲箹閻愭彃顬夌紓浣筋嚙閻楁挸顕f繝姘╅柍鍝勫€告禍鐐烘⒑缁嬫寧婀扮紒瀣灴椤㈡棃鏁撻敓锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋涢ˇ鐢稿极瀹ュ绀嬫い鎾跺Х閸橆垶姊绘担绛嬫綈鐎规洘锕㈤、姘愁樄鐎规洘甯℃俊姝岊槼闁哥姵鍔欓弻锟犲礃閵娧冣叡閻庤鎸风欢姘跺蓟濞戙垹鐒洪柛鎰典簴婵洭姊洪崫鍕櫤闁诡喖鍊垮濠氬Ω閳哄倸浜為梺绋挎湰缁嬫垿顢旈敓锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸婂潡鏌ㄩ弴妤€浜惧銈庝簻閸熸潙鐣风粙璇炬梹鎷呴梹鎰殫闂傚倷绀佹竟濠囧磻娓氣偓瀹曟洘娼忛埡鍐箵濠德板€撻懗鍓佺不妤e啯鐓欓悗娑欋缚閹冲啴鏌h箛濠冩珖闁汇儺浜獮鍡氼檨闁绘挸銈搁弻锛勪沪鐠囨彃顫囬梺璇″枔閸婃繂鐣烽幒鎴旀婵妫旂槐锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾圭€瑰嫭鍣磋ぐ鎺戠倞闁靛ě鍛獎闂備礁澹婇崑鎺戭熆閳ь剟鏌i幒鎴敾闁靛洤瀚粻娑㈠箻閹颁椒妲愰梻浣告惈椤戝棝鎮ч悩璇茶摕闁跨喓濮撮悙濠囨煃鏉炴媽顔夐柛瀣崌閺佹劖寰勭€n偅鐝冲┑鐘灱濞夋盯顢栭崱妞绘瀺闁靛繈鍊栭埛鎴︽偣閹帒濡兼繛鍛姍閺岀喖宕欓妶鍡楊伓 缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂寸绾惧綊鏌熼梻瀵割槮缁炬儳婀辩槐鎺斺偓锝庡亾缁扁晜绻涘顔荤盎閸ユ挳姊虹化鏇燁€嗛柡鍛矒椤㈡瑩寮崼鐔叉嫼閻熸粎澧楃敮妤呮晬閻旇櫣纾奸悹浣告贡缁♀偓閻庢鍣崑鍛崲濠靛鐐婇柕濞у啫姹查梻鍌欒兌缁垰煤閺嶎厼纾归柛锔诲幐閸嬫挸顫濋悙顒€顏� 濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忛柣鎴f閺嬩線鏌涘☉姗堟敾闁告瑥绻橀弻鐔虹磼閵忕姵鐏嶉梺鍝勬噺缁诲牓寮婚弴銏犻唶婵犲灚鍔栭埢鎾绘⒑鏉炴壆顦﹂悗姘嵆瀵鈽夐姀鈺傛櫇濡炪倖甯掗崐鏄忔懌闂傚倷鐒︾€笛囧礃婵犳艾绠柨鐕傛嫹 闂傚倸鍊搁崐宄懊归崶顒夋晪鐟滃秹婀侀梺缁樺灱濡嫮澹曟繝姘叆婵犻潧妫Σ鍝ョ棯閹规劦娼愮紒缁樼洴楠炲鎮欓崘鈺佸摵鐎殿喗鎮傚浠嬪Ω瑜忛鏇㈡⒑閻熸壆鎽犻柣鐔村劦閹偛煤椤忓懐鍘告繛杈剧到婢瑰﹪宕曢弮鍫熺厸閻忕偠顕ф慨鍌炴煙椤斿搫鈧繂鐣烽幒鎴旀婵妫旂槐锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柟闂撮檷閸嬫垿鏌熺紒銏犳灈缁炬儳顭烽弻娑㈠即閵娿儮鍋撶€n€㈡椽顢旈崟骞喚鐔嗛悹铏瑰皑閸旂喖鏌$仦鐣屽ⅵ婵﹨娅i幉鎾礋椤愩垹笑婵犵妲呴崑鍕偓姘煎枤閸掓帡宕奸妷銉╁敹闂侀潧顧€婵″洭宕i崱娑欌拺缂備焦蓱缁€鈧梺绋匡工濠€閬嶅焵椤掍胶鍟查柟鍑ゆ嫹 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戝鈧倿顢欓悙顒夋綗闂佸搫娲㈤崹鍦缂佹ḿ绠鹃柟瀛樼懃閻掓椽鏌℃担绋款伃闁哄本鐩俊鐑筋敊閻撳寒娼荤紓鍌欑劍閸旀牠銆冩繝鍥ц摕闁绘梻鍘х粻鏌ユ煙娴煎瓨娑ф繛鍫弮濮婃椽宕ㄦ繝鍌滀患婵犵數鍋愰崑鎾绘⒑閸濆嫯顫﹂柛鏃€鍨块獮鍐Χ婢跺﹦锛滃┑鐐村灦閿曗晜瀵奸敓锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗霉閿濆浜ら柤鏉挎健瀵爼宕煎☉妯侯瀷婵炲濮电喊宥嗙┍婵犲洦鍊锋い蹇撳閸嬫捁顦寸紒杈ㄦ尭椤繄鎹勯搹璇℃敤闂備胶鎳撴晶搴ㄥ疾椤愩垻鏆ゅù锝囩《閺€浠嬫煟濡搫绾у璺哄閺岋繝宕ㄩ钘夆偓鎰版煛鐏炶濮傞柟顔哄€濆畷鎺戔槈濮楀棔绱� 濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忛柣鎴f閺嬩線鏌熼梻瀵割槮缁惧墽绮换娑㈠箣濞嗗繒浠鹃梺绋垮濡啴寮婚妶鍚ゅ湱鈧綆鍋呴悵鏃堟⒑閹肩偛濡界紒璇插暣婵$敻宕熼姘敤濡炪倖鍔﹀鈧紒顔肩埣濮婃椽鎸婃径濠冩闂佸摜濮甸悧鐘差嚕婵犳碍鏅插璺猴功閻嫰姊虹粙娆惧剰闁哥喎鐏濋敃銏ゅ础閻愨晜鐎婚梺闈涚箞閸婃牠宕愰悜鑺ョ厱妞ゎ厽鍨垫禍婊堟煛鐎n偄鐏撮柟顔筋殜閻涱噣宕归鐓庮潛婵$偑鍊х€靛矂宕归崼鏇炵畾閻忕偠濞囬弮鍫濆窛妞ゆ梹鍎冲鎶芥⒒娴h櫣甯涙繛鍙夌墵瀹曟劙宕烽娑樹壕婵ḿ鍋撶€氾拷
  您所在的位置:首页 > 专题栏目 > 胃癌专题 > 文献资料 用户登录 新用户注册
增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应

增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对胃癌细胞的抑瘤效应

中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 基础研究

作者:戴林 张学庸 惠宏襄 王成济 樊代明

单位:116021 大连,解放军第二一○医院(戴林);西安第四军医大学西京医院(张学庸、樊代明),分子生物学教研室(惠宏襄、王成济)

  关键词: 胃肿瘤  细胞株  增殖细胞核抗原  RNA,反义  基因治疗

  【摘要】 目的 观察增殖细胞核抗原(PCNA)基因反义RNA表达质粒对胃癌细胞生长特性的影响,探讨其抗肿瘤作用。方法 用DNA重组方法将PCNA基因反向克隆到真核表达质粒pDOR-neo中,构建成PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA,用脂质体介导转染胃癌细胞系SGC-7901。结果 经G418筛选获得转染细胞SGC/PCNA,与亲本细胞相比,其生长速度减慢,RNA、蛋白质的生物合成受到抑制,S期、G2/M期DNA含量降低。结论 PCNA基因反义RNA对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。

  Construction of PCNA antisense RNA expression vector and its antitumorigenic effect on human gastric cancer cell  Dai Lin, Zhang Xueyong, Hui Hongxiang, et al. Department of Gastroenterology, 210 Hospital of PLA, Dalian 116021

  【Abstract】 Objective To observe the effect of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) antisense RNA on the growth characteristics of human gastric cancer cell. Methods An eukaryotic expression vector pDR-PCNA with human PCNA gene insert in reverse direction was successfully constructed. The human gastric cancer cell line SGC-7901 was transfected with pDR-PCNA by lipofectamineTM. Results Growth rate, protein and RNA biosynthesis and DNA contents in S-phase and G2/M-phase of the transfected SGC-7901 were significantly suppressed in comparison with those of the parental cell line. Conclusion PCNA antisense RNA can significantly suppress the in vitro growth of gastric cancer cell line.

  【Subject words】 Stomach neoplasms  Cell line  Proliferating cell nuclear antigen  RNA, antisense  Gene therapy

  增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear ant- igen, PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助因子,在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。PCNA在许多肿瘤组织中都有高表达[1],并随肿瘤浸润深度增加及转移,其表达呈明显上升趋势[2]。Sakakura等[3]用18-mer PCNA反义ODN抑制了多种胃癌细胞系的生长。提示PCNA与肿瘤发生、发展关系密切,有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。为研究PCNA基因与胃癌的关系,探索胃癌基因治疗的靶基因,我们构建了PCNA基因反义RNA真核表达质粒,并观察其对胃癌细胞的抑瘤效应。

材料与方法

  1.基因与载体:pT7hPCNA质粒由美国冷泉港分子生物学实验室Waga博士惠赠,在其表达载体p30382XT的XbaI、BamHI位点间插有PCNA基因。真核细胞表达质粒pDOR-neo由英国皇家癌症研究会Morgenstern博士惠赠。

  2.主要试剂:Lipofect amineTM脂质体药盒购自Gibco公司,G418购自Sigma公司,[α-32p]UTP购自北京福瑞公司,限制性内切酶、连接酶购自华美生物技术有限公司。

  3.质粒制备:DNA片段回收、DNA连接、细菌转化及基因鉴定参照《分子克隆实验指南》[4]进行。

  4.DNA转染:用Lipofect AMINETM介导将空载质粒pDOR-neo及重组质粒pDR-PCNA转染至胃癌细胞SGC-7901(由军事医学科学院毒物药物研究所引入),分别命名为SGC/neo和SGC/PCNA,并以SGC-7901作为阴性对照。转染72小时后,用G418(400 μg/ml)筛选3周,挑取单个抗性细胞在G418(100 μg/ml)下常规培养扩增。

  5.细胞生长曲线:在24孔培养板中,分别于每孔接种每毫升3×104个细胞,每日取各种克隆细胞株3孔,0.25%胰酶消化计数,连续5天,绘制出生长曲线。

  6.RNA单链探针的制备及RNA斑点杂交:将PCNA基因头尾端克隆至pEG3Z质粒的HindⅢ和BamHI位点间,分别利用SP6、T7启动子体外转录盒(Riboprobe Kit,美国promega公司),及[α-32p]UTP标记出正义和反义PCNA RNA单链探针。提取SGC-7901和经转染72小时后的SGC/PCNA细胞RNA,按常规方法进行RNA斑点杂交。

  7.免疫组织化学染色及图像分析:取经转染72小时的3组细胞爬片,经冷丙酮固定后,进行ABC免疫组化染色,观察PCNA表达的变化,同时进行图像分析。

  8.细胞周期测定:取1×106对数生长期单细胞悬液,0.01 mol/L pH7.4 PBS洗涤后,70%乙醇固定,PI(propidium iodide)染色,应用Partec-CAⅡ型流式细胞仪(FCM)检测细胞DNA含量。

  9.透射电镜观察:SGC/PCNA、SGC/neo和SGC-7901 3种细胞各取1×106,经0.01 mol/L pH7.4 PBS洗涤后,加入6%小牛血清白蛋白,粘合反应30分钟,离心弃上清,25%戊二醛4℃固定24小时,按常规电镜制作技术制备电镜标本,600~800 nm的超薄切片收集于带膜的铜网上,经铀、铅电子染色后,行电镜(JEM-2000EX)观察。

结果

  1.PCNA反义RNA表达质粒的构建及鉴定:用BamHI和XbaI酶切质粒pT7hPCNA,得到1.3kbPCNAcDNA全长序列,将其插入到pUC19质粒Bam HI~XbaⅠ间,成为pUC-PCNA,再分别用PstI、EcoR I、Kpn I和Sal I-BamHI进行酶切分析,得到大小不同的片段。这些片段与PCNAcDNA序列一致。回收SalI-BamHI片段并将其反向(定向克隆)插入到pDOR-neo(6.5kb)的BamHI-SalI位点间,经连接、转化和酶切,鉴定筛选出重组质粒(图1),并将其命名为pDR-PCNA。

  2.细胞生长曲线:SGC/PCNA细胞经G418筛选后,其生长速度与亲本细胞SGC-7901相比明显减慢,在培养第5天,细胞生长抑制达59%。而SGC/neo细胞生长速度与亲本细胞相比,无明显改变(图2)。

  3.细胞内mRNA水平变化:PCNA正义RNA单链探针检测到SGC/PCNA细胞有较强的杂交信号,

  1:pDR-PCNA经SalI-BamHI酶切 2:λDNA/HindⅢ DNA分子量标准 3:pDR-PCNA质粒

图1 重组质粒pDR-PCNA酶切电泳分析

图2 细胞生长曲线

  而SGC-7901细胞无杂交信号产生。表明pDR-PCNA已整合至SGC-7901细胞染色体中,并有较高浓度的PCNA反义RNA表达(图3a)。反义PCNA RNA单链探针检测到SGC-7901细胞有强杂交信号,而SGC/PCNA细胞也有杂交信号出现,但较SGC-7901细胞明显减弱,表明SGC/PCNA细胞正义PCNA mRNA的表达被部分抑制(图3b)。经对杂交斑点薄层扫描(CX-9000薄层扫描仪,日本岛津),SGC/PCNA细胞PCNA mRNA被抑制47.5%。

  A:PCNA正义RNA探针检测反义RNA B:PCNA反义RNA探针检测正义RNA 1:SGC/PCNA  2:SGC-7901

图3 RNA斑点杂交

  4.免疫组化染色:免疫组化染色显示,SGC/PCNA细胞体积缩小,阳性细胞所占比例及染色深度较SGC-7901细胞明显降低,而SGC/neo与SGC-7901大体相同。用图像分析法对每张染片5个高倍视野中124个阳性细胞灰度、面积进行测定,结果显示两组差异有非常显著性(P<0.0001)。

  5.转染细胞的周期分布:FCM分析显示,SGC/PCNA细胞与SGC-7901相比,G1期细胞增加20.5%,而S期和G2/M期细胞分别减少29.8%和21.2%。SGC/neo与SGC-7901细胞相比无明显变化(附表)。

附表 FCM测定细胞周期分布

组别 DNA含量(%)
G0/G1 S G2+M
SGC-7901 57.1 32.6 10.4
SGC/neo 48.1 30.8 21.1
SGC/PCNA 68.8 23.0 8.2

  6.转染细胞超微结构变化:透射电镜观察SGC-7901和SGC/neo细胞形态正常,核仁、染色体及细胞器清晰可见,核膜包膜完整。而SGC/PCNA细胞形态出现多种改变,不仅有空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀,而且部分细胞出现核染色质浓集成块,在核膜下边集,呈月牙状。

讨论

  胃癌的发生机制十分复杂,不仅涉及多种癌基因、抑癌基因的变化,而且一些细胞因子在胃癌的发生发展中也起到一定的作用。尽管这些基因、细胞因子对细胞的作用方式不同,作用途径和作用部位有别,但最终结果都将导致细胞的恶性增殖。因此,遏制细胞的恶性增殖是肿瘤治疗的基础。

  PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子,不仅在DNA复制中起到关键作用,而且来自细胞内外的增殖信号都须经过PCNA的参与,才能引发DNA的合成。众多研究表明,PCNA在几乎所有肿瘤组织中都有高表达[5,6],我们免疫组化研究也表明,PCNA在胃癌的阳性表达率为100%,并与胃癌淋巴结转移密切相关[7]。为此,我们选择PCNA作为胃癌基因治疗的靶位,用真核细胞质粒载体表达的PCNA反义RNA特异性封闭肿瘤细胞的mRNA,以期控制癌细胞的增殖,达到治疗肿瘤的目的。实验结果表明,当pDR-PCNA转染胃癌细胞后,反义RNA单链探针检测到SGC/PCNA细胞内PCNA正义RNA水平降低47.5%;转染细胞的免疫组化染色强度明显降低,阳性细胞所占比例下降;SGC/PCNA生长速度明显减慢,G1期DNA含量增多,而S期、G2/M期含量降低。这些变化主要是由于PCNA被抑制后,细胞内DNA合成减少,致使癌细胞增殖受阻。此外,SGC/PCNA细胞超微结构发生了变化,如空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀等,部分细胞出现胞浆固缩和染色质浓缩边集等改变。这种变化是否与细胞凋亡有关,还有待进一步证实。有关PCNA与凋亡的关系尚未见报道,但这一现象的出现,为我们更深入了解PCNA的作用及细胞调控机制提供了一种参考数据。

  上述结果提示,用PCNA基因反义RNA阻断其特定的基因表达,可以抑制SGC/7901胃癌细胞的增殖,改变肿瘤细胞的生物学行为。合理地利用反义技术以改变和逆转肿瘤细胞的恶性表型,是肿瘤基因治疗的一个方向。

参考文献

  1Robbins BA, Vega D, Ogata K, et al. Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen in solid human malignancies. Arch Pathol Lab Med, 1987, 111:841-845.

  2Maeda K, Chung YS, Onoda N, et al. Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative biopsy specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis. Cancer, 1994, 73: 528-533.

  3Sakakura C, Hagiwara A, Tsujimoto K, et al. Inhibition of gastric cancer cell proliferation by antisense oligonucleotides targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen. Br J Cancer, 1994, 70: 1060-1066.

  4J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯(金冬雁,黎孟枫等译). 分子克隆实验指南. 第2版. 北京:科学出版社,1992.

  5Wiethege T, Voss B, Muller KM. p53 accumulation and proliferating cell nuclear antigen expression in human lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol, 1995, 121: 371-377.

  6Taniai M, Tomimatsu M, Okuda H. Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen in hepatocellular carcinoma relationship to histological grade. J Gastrenterol Hepatol, 1993, 8: 420-425.

  7戴林,张学庸,陈宝军,等. 增殖细胞核抗原与胃癌淋巴结转移的关系. 第四军医大学学报,1996,17: 169-171.

(收稿:1998-01-14  修回:1998-02-27)


页面功能 参与评论】【字体: 打印文章关闭窗口
下一编:细胞粘附分子CD44S、CD44V6在胃癌组织中的表达及其意义
焦点新闻
·小儿中枢神经系统白血病间歇性放射治疗的临床研究(附1
·树突状细胞与髓性白血病的免疫治疗
·急性髓系白血病M2b型分子生物学特征的鉴定
·高三尖杉酯碱的临床药物动力学及其在急性白血病化疗中
·抗凋亡基因bcl-x<sub>L</sub>与白血病细胞耐药的相关
·Flt3基因在白血病中的表达及临床意义
·急性髓细胞白血病早期病死高危因素及高白细胞髓性白血
·反义bcl-2基因转染对单核白血病细胞存活及化疗耐受能
温馨提示:如果您怀疑自己有某种健康问题,可到健康社区交流咨询或尽快去医院就医治疗。

栏目列表


Copyright © 2016闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣椤愯姤鎱ㄥ鍡楀幊缂傚倹姘ㄩ幉绋款吋閸澀缃曢梺璇查閸樻粓宕戦幘缁樼厱闁哄洢鍔屾禍鐐烘煥濞戞瑧娲存慨濠冩そ瀹曠兘顢橀悙韫帛闂佹眹鍩勯崹鎶芥偟閻掑穯.com闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣椤愯姤鎱ㄥ鍡楀幊缂傚倹姘ㄩ幉绋款吋閸澀缃曢梺璇查閸樻粓宕戦幘缁樼厱闁哄洢鍔屾禍鐐烘煥濞戞瑧娲存慨濠呮濞戠敻宕担鍛婃毌闂佸湱鍘ч顓€偑閿燂拷 rights reserved. 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾归柣鎴eГ閸ゅ嫰鏌涢幘鑼槮闁搞劍绻冮妵鍕冀椤愵澀鏉梺閫炲苯澧柛鐔告綑閻g兘濡歌閸嬫挸鈽夊▍顓т簼缁傚秵娼忛妸褏鐦堥梺姹囧灲濞佳冪摥闂備胶枪閿曘倝顢氶鐘愁潟闁圭偓鍓氬ḿ鈺呮煠閸濄儲鏆╅柛妯哄船椤啴濡堕崱妤€顫庢繝娈垮枟閹稿啿鐣峰┑鍡╂僵閺夊牃鏅濋敍婊堟⒑缂佹﹫渚涢柛鐘崇墵瀹曟繈鏁冮崒娑氬幐闁诲繒鍋熼弲顐㈡毄婵$偑浼囬崒婊呯崲闂佸搫鏈惄顖炵嵁濡吋宕夐柣鎴炨缚閳ь剝顕ч—鍐Χ閸℃ḿ鈹涚紓鍌氱С缁舵岸鐛崘鈺冾浄閻庯綆浜滅粣娑欑節閻㈤潧孝闁哥噥鍨堕、鏃堟偄閸忓皷鎷绘繛杈剧秬婵倗娑甸崼鏇熺厱闁挎繂绻掗悾鍨殽閻愯尙绠婚柡浣规崌閺佹捇鏁撻敓锟� 婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戣棄鏋侀柟闂寸绾惧鏌i幇顒佹儓闁搞劌鍊块弻娑㈩敃閿濆棛顦ョ紓浣哄Т缂嶅﹪寮诲澶婁紶闁告洦鍓欏▍锝夋⒑缁嬭儻顫﹂柛鏃€鍨垮濠氬Χ閸氥倕婀遍埀顒婄秵閸嬪懘鎮甸幒妤佲拺缂備焦锚缁楁帡鏌ㄩ弴妯衡偓婵嗭耿娓氣偓濮婅櫣绱掑Ο璇茬濠电偛顕崗姗€鐛Δ鍛亹缂備焦岣块崢閬嶆⒑闂堟稓澧曟俊顐n殘缁厼顫濋懜鐢靛帾闂佹悶鍎滈崘鍙ョ磾闁诲孩顔栭崰鏇犲垝濞嗘劒绻嗘慨婵嗙焾濡查攱绻濆▓鍨灈婵炲樊鍘奸~蹇涙惞閸︻厾锛滃┑鈽嗗灥椤曆囨瀹ュ鈷戦柤濮愬€曢弳鈧梺鍛婁緱閸n喖岣块悢鍏尖拺閻熸瑥瀚粈鍐┿亜閺囧棗鎳愰惌鍡涙煕閹伴潧鏋熼柣鎾寸懅缁辨帞鈧綆浜濋崑銉︺亜鎼淬埄娈曢柕鍥у缁犳盯濡烽敃鈧锟� 闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾瑰瀣捣閻棗銆掑锝呬壕濡ょ姷鍋為悧鐘汇€侀弴銏℃櫆闁芥ê顦純鏇熺節閻㈤潧孝闁挎洏鍊濋幃褔宕卞▎鎴犵劶闂佸壊鍋嗛崰鎾剁不妤e啯鐓欓悗娑欋缚閹冲啴鏌h箛锝勯偗闁哄本绋撻埀顒婄秵閸撴瑩寮搁幋锔界厪闁搞儜鍐句純閻庢鍠曠划娆愪繆閹间礁唯妞ゆ梻鐡斿Λ銉╂⒒閸屾瑨鍏岄弸顏呫亜閹存繃顥㈡鐐村姈缁绘繂顫濋鍌ゅ數闂備礁鎲$粙鎺戓缚濞嗘垹鐭嗛柛鎰ㄦ杺娴滄粍銇勯幘璺烘瀻闁诲骏闄勯妵鍕Ψ閵夘灝褎鎱ㄦ繝鍕笡闁瑰嘲鎳橀幖褰掔嵁鎼存挸浜惧┑鐘叉处閻撴盯鏌涘⿰鈧鎺楁焽椤栨侗娈介柣鎰皺缁犲鏌℃担瑙勫磳闁轰焦鎹囬弫鎾绘晸閿燂拷