与肺癌和胃癌转移可能相关的RAB5A基因

中华肿瘤杂志 1999年第3期第21卷 基础研究

作者：李钰　冯会臣　陈宇　邹嵘　张贵寅　李璞

单位：150086 哈尔滨医科大学医学遗传学研究室

　　关键词： 肺肿瘤；胃肿瘤；RAB5A基因；基因表达

　　【摘要】　目的　研究和分离肿瘤转移相关基因，探讨肺癌及胃癌转移发生的分子基础。方法　应用细胞培养、mRNA差异显示技术、cDNA克隆、测序技术、RT-PCR、Northern印迹杂交技术以及免疫组化技术，分析比较了细胞来源相同，但转移能力不同的人肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83-a基因差异表达及其差异表达基因RAB5A在临床胃癌和肺癌标本中存在的实际意义。结果　在两细胞系之间确有明显的差异表达基因存在，RAB5A基因在具有高转移潜能的Anip973中高表达。33例肺癌和47例胃癌样品的石蜡切片经免疫组化检测证实，RAB5A表达程度与肺癌和胃癌的转移有关(P＜0.05)，而且与胃癌分化程度有关。结论　RAB5A是一个可能与肺癌、胃癌转移相关的基因，并可能与胃癌的分化程度有一定关系，分化程度越低，其表达程度越高。

RAB5A, a gene possibly related to metastasis of human carcinoma of the lung and stomach

　LI Yu, FENG Huichen, CHEN Yü, et al.

　　【Abstract】　Objective　To study and isolate tumor metastasis-related genes, and to explore the molecular basis of metastasis of lung and gastric carcinoma.Methods　Using mRNA differential display technique, cDNA cloning and sequencing, RT-PCR, Northern blot and immunocytochemical methods, genes differentially expressed between human lung adenocarcinoma cell lines AGZY83-a and Anip973 were detected. Anip973 was isolated from AGZY83-a with much higher metastatic potential than the parent line.Results　There were significant differences in gene expression between the two cell lines. RAB5A was one of the genes differentially expressed in Anip973 cells. Its gene product is a GTP-binding protein. Paraffin sections of 33 lung carcinoma and 47 gastric carcinoma specimens were examined immunohistochemically. Expression of RAB5A was positive in 87.9% of NSCLC and 91.5% of gastric cancer specimens examined (P＜0.05), and correlated with their metastatic potential and differentiation degree of gastric carcinoma.Conclusion　RAB5A is possibly a metastasis-related gene.

　　【Subject words】　Lung neoplasms　　Stomach neoplasms　　RAB5A gene　　Gene expression

　　肿瘤转移往往是临床肿瘤患者恶性化的标志和死亡的主要原因。尽管目前在肿瘤转移方面已做了较为深入的研究，但肿瘤转移的分子机制仍不完全清楚。为了研究肺癌转移的分子基础，我们选择了人肺腺癌的两个细胞系AGZY83-a和Anip973作为材料，采用mRNA差异显示技术研究了这两个细胞系之间的基因表达差异^［1］。进一步分析发现，作为蛋白质运输及入胞通路的信号调控因子RAB5A基因，在高转移细胞系Anip973中高表达，而在低转移细胞系AGZY83-a中低表达。为确认RAB5A高表达的普遍意义，我们进一步采用免疫组化的方法，检测临床非小细胞肺癌和胃癌石蜡切片中RAB5A蛋白表达情况，现将结果报告如下。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　1.细胞素：两个人肺腺癌细胞系AGZY83-a和Anip973由哈尔滨医科大学病理教研室王吾如教授提供。Anip973是从AGZY83-a筛选而来，接种裸鼠后，表现出比AGZY83-a高得多的转移潜能。

　　2.肺癌和胃癌石蜡切片：随机收集哈尔滨医科大学第三临床医学院病理科1997年～1998年7月资料完整并经病理诊断证实的非小细胞肺癌石蜡包埋组织33例，胃癌47例，正常肺组织7例，正常胃组织10例，并以正常卵巢组织石蜡切片作为对照。

　　二、实验方法

　　1.细胞培养：细胞系生长于RPMD1640培养基中，直到约80%～70%汇合时，分别收获两细胞系的细胞。

　　2.总RNA的提取及mRNA差异显示：收获的细胞用RNA gents^TM总RNA分离系统(Promega公司)分离，并用TRIZOL试剂(Gibco BRL公司)纯化。总RNA用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理，去除DNA污染。采用Gibco BRL公司的cDNA第一链合成试剂盒，分别以GT₁₅G、GT₁₅C和GT₁₅A为引物，按试剂盒推荐的方法略加改进，分别逆转录合成两个细胞系的cDNA第一链。以该第一链为模板，以cDNA第一链合成引物和Operon公司的OPA01-20、OPB01-20随机引物进行RT-PCR扩增(每一引物浓度为10 pmol)，总反应体积为20 μl。在PE480热循环仪上，按下列条件进行PCR：(1)95℃3分钟，40℃5分钟，72℃5分钟。(2)95℃15秒，40℃2分钟，72℃1分钟，25个循环。(3)72℃10分钟。RT-PCR结果经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，条件参见文献［1］。

　　3.差异片段回收、扩增及克隆：切下含差异片段的凝胶，再次PCR。PCR产物经纯化后，与PGEM-T Vector连接，按常规方法进行转化，并在含Ampicillin和X-gal的LB琼脂培养基上筛选，挑取白色克隆，直接进行PCR扩增，经确认插入片段为目的基因片段后，进行质粒扩增和提取。

　　4.克隆产物的序列分析及差异表达的再证实：以获得的纯化质粒为探针，按标准的Northern印迹杂交方法检测两个细胞系基因表达情况。应用ABI 373A DNA自动测序仪，对纯化质粒进行序列分析，将获得的DNA序列进行同源性比较。并根据测序分析的结果设计特异引物，进行Nest-PCR，对克隆质粒及回收的PCR产物进行再证实。

　　5.免疫组化检测：对确认在Anip973细胞系中高表达的RAB5A基因，进行RAB5A蛋白表达检测。兔抗人RAB5A多克隆抗体IgG为Santa Cruz公司产品。细胞系采用FITC荧光检测，组织样品的石蜡切片采用DAB染色方法，操作步骤按说明书进行(FITC试剂盒、SP试剂盒、DAB染色试剂盒均购自迈新生物技术开发公司)。

　　6.结果判断：FITC荧光检测阳性可见细胞膜存在有绿色荧光，DAB染色则根据在细胞质及细胞膜附近出现棕黄色颗粒为阳性，随机计数5个高倍镜(×40)视野中阳性细胞百分率。根据阳性细胞数目，分为阴性(-)：阳性细胞数0%～24%；阳性(+)：阳性细胞数为25%～74%；强阳性(++)：≥75%。

　　7.统计学分析：应用χ²检验。

　　结果

　　1.mRNA差异显示结果：如图1所示，AGZY83-a和Anip973两个细胞系在基因表达方面存在着差异，箭头所示的A15、A16两个片段为有意义片段。

　　M：PBR322/Msp I相对分子质量标记物； A：AGZY83-a；9：Anip 973；锚定引物为GT₁₅C，10-mer引物A11～20

图1　mRNA差异展示指纹图(SYBP^TM GREEN Ⅰ染色)

　　2.PCR鉴定结果：通过对回收凝胶差异片段及克隆质粒进行PCR检测，证实所选克隆内含目的基因片段(图2)。

　　1，4：PBR322/Msp I相对分子质量标记物； 2：A15克隆产物PCR结果； 3：A15回收片段PCR结果

图2　克隆产物再证实的电泳结果

　　3.克隆片段的序列分析及差异表达再证实的结果：对所分离到的在Anip973中高表达的A15和在AGZY83-a中表达的A16克隆片段进行序列分析，经与GenBank数据库比较证实，A15与GTP结合蛋白RAB5A mRNA的同源性为99%，而A16片段为一新序列。对A15片段进行Nest PCR检测，其克隆片段与回收片段含有相同的序列，RT-PCR则证明A15在Anip973中确为高表达(图3)。

　　4.免疫组化检测结果：通过免疫荧光检测证实，RAB5A蛋白的表达与mRNA水平一致，在Anip973中呈现明显的强荧光，而在AGZY83-a细胞中荧光较弱。DAB染色可见，对照的正常肺组织和胃组织中无RAB5A蛋白的表达。33例非小细胞肺癌标本中，阳性13例，强阳性16例，阴性4例，阳性率为87.9%，其转移与RAB5A蛋白的表达情况见表1。47例胃癌标本DAB染色结果表明，胃癌有无转移与RAB5A蛋白的表达程度差异有显著性(P＜0.05，表2，3)。进一步分析不同分化程度的胃癌与RAB5A表达的关系发现，RAB5A的表达随分化程度降低而表达程度增强(表4)。

　　1：A15 Nest PCR产物； 2：AGZY83-a RNA RT-PCR产物的内对照； 3：Anip973 RNA RT-PCR产物，可见与AGZY83-a相同的内对照带和1条Nest PCR产物带； 4：A15原始PCR产物；M：PBR322/Msp Ⅰ相对分子质量标记物

图3　A15片段RT-PCR电泳结果

表1　33例肺癌的转移情况与RAB5A蛋白表达比较

　　注：χ²检验，P＜0.05

表2　正常胃组织和胃癌RAB5A蛋白表达观察

　　注：χ²检验，P＜0.05

表3　胃癌转移情况与RAB5A表达程度的比较

　　注：χ²检验，P＜0.05

表4　40例不同分化程度胃腺癌RAB5A蛋白表达情况

　　讨论

　　寻找与肿瘤转移相关的基因，探讨转移表型形成的分子基础，阐明肿瘤转移机理，是目前肿瘤分子遗传学研究的热点。肺癌为人类最常见的恶性肿瘤之一，而肺腺癌最易发生转移。为此，我们选择了细胞来源相同，但转移能力高低不同的两个人肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83-a为研究材料^［2，3］，采用mRNA差异显示方法，分析这两个细胞系之间的基因差异改变。mRNA差异显示技术简单、快速，可直接分析基因表达的差异变化，是检测和分离差异表达基因的一种有效手段^［4，5］。

　　我们通过3种锚定引物分别与40种随机引物互配，完成了两个细胞系的差异显示分析。对其中以CT₁₅C为锚定引物的A15和A16差异片段进行了回收、克隆，发现前者为RAS超家族成员RAB5A基因，后者为一未知的顺序。作为RAB5A基因，在具有高转移能力的肺腺癌细胞系Anip973中高表达，表明与Anip973的转移表型形成有关。为证实RAB5A在Anip973中，其蛋白质的表达与mRNA具有一致性，即RAB5A高表达是否受到转录后的调控，我们采用免疫荧光技术检测了两细胞系RAB5A蛋白，结果显示RAB5A蛋白在Anip973中也为高表达。这进一步证实了RAB5A高表达与Anip973转移表型相关。

　　通过对具有完整资料的33例肺癌和47例胃癌手术标本的石蜡切片进行RAB5A蛋白差异表达的比较，发现RAB5A表达程度与肺癌和胃癌的转移相关。同时，还证实了RAB5A蛋白在正常胃腺细胞中不表达。进一步分析40例不同分化程度的胃癌免疫组化结果，发现RAB5A的表达程度随分化水平的降低而增高，表明RAB5A的表达可能与胃癌的恶性程度有关。

　　有关RAB5A基因表达及其功能，目前国内外的工作集中于正常细胞的生理功能方面，其在肿瘤恶性演进及转移中的作用和调控未见报道。对人类RAB5A mRNA表达分析表明，该基因在脑、卵巢和睾丸组织中高表达，而在其他组织中几乎不表达或表达量极低^［6］。

　　本研究结果表明，RAB5A对肿瘤转移表型的影响可能是通过其高表达引起，这与以往研究发现的某些肿瘤的侵袭能力的获得是与癌基因的扩增与过表达相关的结论具有一致性。因此，我们初步认为，RAB5A可能是一个与肺癌、胃癌转移相关的基因。而进一步深入探讨RAB5A在其他肿瘤中的表达将十分有意义。

　　本课题受黑龙江省首届杰出青年基金和国家教委跨世纪人才基金资助

　　参考文献

　　1　孟祥文，李钰，张贵寅，等.应用mRNA差异显示技克隆人肺腺癌转移相关基因.中华医学遗传学杂志，1997，14：129-133.

　　2　王玉利，王吾如.人肺腺癌细胞系的建立及生物学特性.肿瘤临床，1985，12：184-187.

　　3　王吾如，潘忠诚，袁孝纯，等.裸小鼠腹腔内筛选转移人肺腺癌细胞及其生物学特性的研究.中华肿瘤杂志，1987，9：412-415.

　　4　Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messager RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992,257：967-971.

　　5　Liang P, Zhu WM, Zhang XY, et al. Differential display using one-base anchored oligo-dT primers. Nucleic Acids Res, 1994, 22：5763-5764.

　　6　Chavrier P, Rarton RG, Huri HP, et al. Localization of low molecular weight GTP binding proteins to exocytic and endocytotic compartments. Cell, 1990,62：317-319.

收稿：1998-10-07　　修回：1998-11-30