胃癌细胞凋亡过程中胞内Ca²⁺和三磷酸肌醇浓度的改变

中华肿瘤杂志 1999年第4期第21卷 基础研究

作者：邢承忠　陈峻青　徐惠绵

单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院肿瘤科

　　关键词： 胃肿瘤；顺铂；细胞凋亡；钙/代谢；肌醇1，4，5-三磷酸/代谢

　　【摘要】　目的　探讨顺铂诱导胃癌细胞凋亡过程中细胞内游离Ca²⁺浓度(［Ca²⁺］i)和三磷酸肌醇(IP₃)浓度的变化特点和意义。方法　选择顺铂诱导胃癌细胞凋亡，采用光镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡。Fura-2荧光负荷技术测［Ca²⁺］i，竞争性蛋白结合法测定IP₃浓度。结果 顺铂浓度为2 μg/ml作用于BGC823胃癌细胞24小时出现典型的凋亡改变。胃癌细胞凋亡过程中，胞内［Ca²⁺］i明显升高，以凋亡早期更为明显。胃癌细胞凋亡早期(30秒)，IP₃浓度明显升高，到凋亡晚期(2～24小时)，IP₃浓度明显降低。结论　在胃癌细胞凋亡过程中，［Ca²⁺］i表现为上调趋势。IP₃浓度在凋亡早期，表现为上调趋势，在稍晚阶段，表现为下调趋势，这为治疗胃癌提供新靶点。

Changes in ［Ca²⁺］i and IP₃ levels in the process of cisplatin-induced apoptosis of gastric carcinoma　

XING Chengzhong, CHEN Junqing, XU Huimian. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001

　　【Abstract】　Objective　To study the change and significance of intracellular-free calcium levels (［Ca²⁺］i) and inositol 1, 4, 5-trisphosphate (IP₃) levels in the process of gastric carcinoma cell apoptosis induced by cisplatin.Methods　Apoptosis induced by cisplatin in gastric carcinoma BGC823 cell was investigated by light and electronmicroscopy, agarose gel electrophoresis and flow cytometry. ［Ca²⁺］i was determined by Fura-2 fluorescin load technic, IP₃ was determined by competitive protein binding method.Results　When BGC823 cells were treated with cisplatin (2 μg/ml) for 24 hours changes appeared typical of apoptosis. ［Ca²⁺］i and IP₃ were significantly increased, especially at the initial stage of apoptosis. However, from 2 to 24 hours after cisplatin treatment, IP₃ levels progressively decreased, being significantly lower than those of the untreated controls.Conclusion　In the process of cisplatin induced apoptosis of gastric carcinoma cells, ［Ca²⁺］i and IP₃ levels are up-regulated at the very initial stage but down-regulated from 2 hours afterwards.

　　【Subject words】　Stomach neoplasms　　Cisplatin　　Apoptosis　　Calcium/metabolism　　Inositol 1, 4, 5-triphosphate/metabolism

　　近年对胃癌细胞凋亡的分子机制，特别信号转导机制的研究，日趋受到学者们的重视。在胞浆多条信号转导通路中，作为第二信使的细胞内游离Ca²⁺(［Ca²⁺］i)和三磷酸肌醇(IP₃)是重要的信号分子。我们用顺铂诱导胃癌细胞BGC823凋亡，建立凋亡模型，观察胃癌细胞凋亡过程中［Ca²⁺］i和IP₃的变化特点，为今后通过阻断信号转导诱导细胞凋亡来治疗胃癌提供新线索和新靶点。

　　 材料与方法

　　1.主要试剂和仪器：顺铂为山东齐鲁制药厂产品，钙荧光指示剂Fura-2/AM为美国Sigma公司产品，［³H］三磷酸肌醇检测系统英国Amersham Life Science公司产品。流式细胞仪FAC Scan美国Becton Dickinson公司产品，电泳仪DGENE美国Bio-Rad公司产品，F-2000荧光分光光度计日本Hitachi公司产品，液体闪烁计数仪LS-6500美国Beckman公司产品。

　　2.细胞培养和凋亡检测：胃癌细胞系BGC823(由北京医科大学引进)复苏后培养，加顺铂至终浓度为2 μg/ml，选择不同时间点，用光镜、透射电镜和扫描电镜制片观察凋亡的形态学变化。收集各时间点细胞(10⁶个)，提取DNA，用含溴化乙锭的1.5%的琼脂糖电泳，观察DNA条带。收集各时间点细胞(10⁶个)，制成细胞悬液，用流式细胞仪进行细胞周期分析，激光激发波长为488 nm。

　　3.［Ca²⁺］i的测定：待测细胞制成细胞悬液，细胞活性在95%以上，终浓度5 μmol/L Fura-2/AM负载45分钟，用HPSS终止反应，离心洗涤两次，最后细胞悬液于HPSS中调整细胞数为2×10⁶个/ml，以分光光度计检测，发射波长为510 nm，激发波长为340 nm及380 nm，两波长下最大荧光由加入终浓度为0.2% Triton测得，最小荧光由加入终浓度为8 mmol/L(pH＞8.5)的EGTA获得，每次测Ca²⁺前输入在上述两激发波下测得的细胞悬液自发荧光值及解离常数(224 nmol/L)，输入电脑软件运算可得［Ca²⁺］i。

　　4.IP₃检测方法：待测细胞(1×10⁷个)于液氮中中止反应，-70℃保存。将各个样品，于0℃下研磨成粉未，再加入15%三氯乙酸2 ml，混匀，静置15分钟，离心(每分钟2 000转，15分，4℃)，取上清1 ml加入3 ml水和饱和乙醚，充分混匀离心(每分钟2 000转，15分，4℃)，弃上层油相，反复3次，下层水相用2 mol/L NaHCO₃调pH为7.5，-20℃保存，备测IP₃。按说明书制做标准曲线，测IP₃浓度。

　　5.统计学处理用t检验。

　　结果

　　1.顺铂诱导胃癌细胞系BGC823凋亡及其检测：加顺铂到终浓度为2 μg/ml诱导凋亡，加药后24小时出现典型的凋亡改变。在相差显微镜下观察，用顺铂处理24小时后见细胞核浓缩，细胞变圆，可见膜突起起泡，细胞完整，见凋亡小体。透射电镜下见典型凋亡，核染色质积聚边集，新月形或帽状，细胞器结构清晰，胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片。扫描电镜下见细胞变圆，胞膜突起起泡，胞核浓缩。琼脂糖凝胶电泳：在电泳带上呈现有一定间隔的梯状条带。流式细胞仪：见G₁峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，对照组无此特征。

　　2.胃癌细胞凋亡过程中［Ca²⁺］i和IP₃浓度的检测：胃癌细胞凋亡启动时［Ca²⁺］i明显高于对照组，随后［Ca²⁺］i较凋亡开始时有所下降，但也高于对照组，差异显著。胃癌细胞凋亡早期IP₃浓度比对照组高，而后IP₃浓度较对照组低(表1)。

　　讨论

　　顺铂是临床上胃癌化疗的常用药，疗效较为可靠^［1，2］，故本研究选择顺铂为诱导胃癌细胞凋亡的药物。结果表明，在终浓度为2 μg/ml的条件下，处

表1　胃癌细胞凋亡过程［Ca²⁺］i和IP₃的浓度变化(±s)

　　注：t检验P值为加药组与对照组比较

理胃癌细胞系BGC823 24小时，可发现典型的细胞凋亡特征：(1)光镜和电镜检查见形态学改变为细胞变圆、胞膜突起起泡、胞核浓缩边集，可见凋亡小体。(2)琼脂糖凝胶电泳可见典型的梯状条带。(3)流式细胞仪见G₁峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。说明顺铂可以通过诱导细胞凋亡的方式，发挥其抗肿瘤作用，同时也建立凋亡模型，为进一步研究胃癌细胞凋亡的分子机制奠定实验基础。

　　内源或外源信号经胞膜、胞浆传至胞核引起基因及蛋白质的变化，此过程称为信号传导，而胞浆信号传导主要包括3条信号传导通路，既腺苷酸环化酶系统、肌醇脂质系统和钙-钙调蛋白系统。Ca²⁺、IP₃、环磷酸腺苷和蛋白激酶C等信号分子是3条通路的主要信号分子，其中Ca²⁺在信号传导中起重要作用，是各条信号传导途径的枢纽^［3，4］。因此，本研究首先选择Ca²⁺、IP₃作为研究胃癌细胞凋亡信号传导机制的突破点。结果表明，胃癌细胞凋亡早期胞浆游离Ca²⁺浓度明显升高为(244.00±9.85) nmol/L，对照组为(126.67±3.06) nmol/L，差异有显著性，而后胞浆游离Ca²⁺浓度下降较明显，为(187.67±4.51) nmol/L，但仍高于对照组。IP₃浓度在胃癌细胞凋亡早期明显升高，与对照组比较差异有显著性，随后IP₃浓度呈下降趋势，明显低于对照组。此研究说明，Ca²⁺、IP₃参与胃癌细胞凋亡的信号传导过程，［Ca²⁺］i表现为明显上调趋势，特别在凋亡启动阶段(早期)其作用尤为重要。IP₃浓度在凋亡过程中除早期外，表现为明显下调趋势；在研究卵巢癌、乳癌和肝细胞癌细胞凋亡时发现，［Ca²⁺］i、IP₃浓度呈类似的变化^［5，6］。结果表明，Ca²⁺、IP₃在胃癌细胞凋亡信号传导过程有重要作用，但在胃癌细胞凋亡早期IP₃升高，可能由于在凋亡启动阶段激活内源性核酸内切酶需大量Ca²⁺，而IP₃的升高，有利于促进胞浆内Ca²⁺池释放Ca²⁺，进一步的机制有待于深入研究。

　　我们虽然阐明了信号分子Ca²⁺和IP₃在胃癌细胞凋亡过程中的变化特点，为搞清胃癌细胞凋亡时［Ca²⁺］i升高的发生机制，我们在研究胃癌细胞凋亡时，与［Ca²⁺］i升高有关的Ca²⁺通道活性的研究应进一步加强。与IP₃合成分解有关的磷脂酰激酶-4-磷酸激酶、磷脂酰激醇激酶和磷脂酶C的研究也应进一步加强。另外，如何把此研究成果转化为抗信号传导诱导细胞凋亡的药物开发也是今后研究的一个重要方面。

　　本课题受辽宁省自然科学基金资助(编号 972276)

　　 参考文献

　　1　Ormerod MG, Oneill CF, Robertson D, et al. Cisplatin induces apopto-sis in a human ovarian carcinoma cell line with concomitant inter-nucleosomal degradation of DNA. Exp Cell Res, 1994,211：231-237.

　　2　陈峻青.第一届国际胃癌学术会议简介.中华医学杂志，1995，75：634-636.

　　3　Cole KA, Kohn EC. Calcium-mediated signal transduction: biology, biochemistry and therapy. Cancer Metastasis Rev, 1994,13：33-41.

　　4　曹泽毅.激素受体及临床应用.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993，48-70.

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　　6　Weber G, Shen F, Prajda N, et al. Regulation of the signal transduc-tion program by drugs. Advan Enzyme Regul, 1997,37：35-55.

(收稿：1998-08-21　　修回：1998-12-01)