CEA mRNA、CEA蛋白及细胞学检测胃癌腹腔液中游离癌细胞的初步评价

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 临床研究

作者：徐惠绵　王剑峰　王振宁

单位：徐惠绵(中国医科大学第一临床学院肿瘤科,110001,沈阳)；王剑峰(中国医科大学第一临床学院肿瘤科,110001,沈阳)；王振宁(中国医科大学第一临床学院肿瘤科,110001,沈阳)

　　关键词： 胃肿瘤；CEA mRNA/分析；CEA蛋白/分析；腹腔液

　　【摘要】　目的　比较腹腔冲洗液中CEA mRNA、CEA蛋白和细胞学检测游离癌细胞及预测腹膜转移的应用价值。方法　术中收集43例胃癌和10例胃良性病变的腹水或腹腔冲洗液，分别采用RT- PCR方法测定腹腔液中游离癌细胞CEA mRNA表达，放射免疫检测上清液中CEA蛋白含量(p-CEA)，同时做腹腔冲洗细胞学(peritoneal lavage cytology, PLC)检查。结果　CEA mRNA表达阳性率(56.3%)明显高于p-CEA(38.1%)或PLC (33.0%，P＜0.05～0.01)。CEA mRNA表达量随侵袭深度、病期进展而增加(P＜0.05)，因大体类型、浆膜类型不同，其阳性表达级别差异有显著性(P＜0.05)。结论　三种方法均适用于胃癌腹腔脱落癌细胞的诊断或腹膜转移的预测,但对微量癌细胞检出的灵敏性，以RT-PCR方法为优。

The value of CEA mRNA、 CEA protein and cytology of peritoneal washings in the prediction of metastasis of gastric cancer

XU Huimian, WANG Jianfeng, WANG Zhenning.

　　（Department of Oncology, First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China）

　　【Abstract】　Objective　To ascertain the usefulness of CEA determination and cytology of peritoneal washings in the prediction of metastasis of gastric cancer to the peritoneum.Methods　CEA was detected at mRNA level by RT-PCR and at protein level by radioimmunoassay (RIA). Cytologic examination was done by conventional method. Peritoneal washings were collected during operation from 43 patients with gastric carcinoma and 10 with benign lesions.Results　The positive rate of RT-PCR was 56.3% and that of RIA was 38.1%. Both were more sensitive than that of cytologic examination (33.1%) of free cancer cells in the peritoneal washings. The level of CEA mRNA expression increased with the depth of invasion and stage of the disease. It also varied significantly in tumors different in the gross type and serosal involvement.Conclusion　To detect CEA in peritoneal washings by RT-PCR and RIA, and to examine them for tumor cells by cytotogic method are useful to predict subclinical metastasis to the peritoneam in patients with gastric carcinoma, but RT-PCR is most sensitive.

　　【Subject words】　Stomach neoplasms; CEA mRNA/analysis; CEA protein/analysis; Peritoneal washing

　　进行期胃癌根治术后腹膜转移约占30%～50%，是导致死亡的重要原因。因此，术中早期检出脱落的癌细胞，进而采取有效的阻断治疗，是提高疗效的关键。腹腔冲洗细胞学(peritoneal lavage cytolo-gy, PLC)检查方法已常规用于腹腔脱落癌细胞的检测，腹腔冲洗液中CEA蛋白(p-CEA)技术近年来亦应用于临床，但部分阴性病例仍存在术后腹膜转移问题^［1-3］。目前，RT-PCR方法被应用于检测实体瘤的微转移病灶，显示了较高的灵敏性^［4-6］。我们采用该方法检测胃癌腹腔液中较微量的癌细胞CEA mRNA表达,旨在寻找一种更灵敏、准确的检测手段。

　　材料与方法

　　1.研究对象：病例来源于1998年3月～8月间我科胃癌手术病例43例；另收集10例胃良性病变标本为阴性对照，MNK 74例和HSC 39例胃癌细胞系作阳性对照。

　　2.实验方法：(1)标本采集及p-CEA、PLC检测：手术开腹后，Douglas腔或右隔下置16号导尿管，注入生理盐水50 ml，轻轻搅动后吸出，如已有腹水者直接吸出50 ml，离心沉渣涂片、HE染色、细胞学检查。取上清0.2 ml，放射免疫法检测CEA蛋白含量，具体实验和阳性定量诊断值(≥100 ng/g蛋白) 参照Takayuki方法和标准^［1］。(2)CEA mRNA的RT-PCR检测：取离心沉淀标本0.5 ml，加入Trizol试剂(Gibco公司)，总RNA提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿（AGPC）一步抽取法，紫外定量。(3)RT-PCR扩增^［7］：RT-PCR试剂盒及CEA巢式PCR寡核苷酸引物(Boehringer Man.Co.), 序列为A：5′-TCTGGAAC-TTCTCCT GGTCTCTCAGCTGG-3′；B：5′-TGTAGCTGT-TGC AAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3′；C：5′-GGGCC-ACTG TCGGCTsCATGATTGG-3′。按RT-PCR 系统说明，在反应系统中加入总RNA 5 μl置于50℃下孵育30 min，将mRNA反转录成cDNA。加入引物A和B，加温到94℃，变性30 s，45～72℃下退火30 s，再升温到68℃持续5分20秒，扩增20个循环。离心后将沉渣置于另一个PCR管内，再加入上述反应系统及引物B和C，同样步骤扩增20个循环。取出产物5 μl，在5%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，将凝胶置于UVP系统内扫描，呈现131 bp条带的即为阳性。用GRABIT 2.0电脑软件分析。

　　首先用胃癌细胞系进行RT-PCR扩增，以获得阳性结果的最小数量级。对细胞系所提取的总RNA 50 ng为模板，扩增后所获得的电泳带作为标准阳性对照100%，实验组标本以同样数量的总RNA为模板，在相同的条件下进行扩增，所得的条带与细胞系阳性标准比较，确定相对阳性级别。100%～75%之间为++++，75%～50%为+++，50%～25%为++，25%以下为+。

　　3.病理资料：胃癌原发病灶的大体类型、侵袭深度、浆膜类型及PS因素按日本胃癌病理规约标准，即P(+)：肉眼腹膜转移；S(+)：显微镜下浆膜受侵。

　　4.统计学方法： CEA mRNA与p-CEA、PLC阳性率比较用χ²检验，与PS因素、侵袭深度、大体类型、浆膜类型比较用Redit分析。

　　结果

　　1.CEA mRNA、p-CEA和PLC检查结果：43例胃癌腹腔液中CEA mRNA表达阳性率（56.3%）明显高于p-CEA（38.1%）和PLC（33.0%）（P＜0.05）。p-CEA或PLC阳性病例，CEA mRNA均为阳性。而在p-CEA阴性的28例中有8例、PLC阴性的29例中有10例CEA mRNA表达阳性。说明 RT-PCR技术灵敏性优于p-CEA或PLC方法。p-CEA亦较PLC方法为优，但无统计学意义。而在10例良性病变腹腔冲洗液检查均为阴性结果。

　　2.PS因素与三种方法阳性率比较：本组浆膜内癌S(-)的15例中仅1例CEA mRNA阳性；浆膜受侵S(+)，但无肉眼腹膜转移p(-)的18例中CEA mRNA阳性率（72.2%）明显高于p-CEA(44.4%)和PLC(38.9%) (P＜0.05～0.01);如合并肉眼腹膜转移p(+)，三种方法阳性率均明显增加（90%、70%、60%），其中CEA mRNA较PLC差异有显著性(P＜ 0.05)，说明腹腔脱落癌细胞数量与PS因素密切相关(表1) 。

表1　不同PS因素与CEA mRNA、p-CEA和PLC

　　阳性率的比较

表2　不同病理因素CEA mRNA阳性级别Redit分析

　　注：-、+、++、+++、++++：CEA mRNA阳性级别　^*P＜0.05

　　3.病理因素与CEA mRNA表达阳性级别对比分析：本实验以细胞系PCR扩增获得的阳性电泳带作对照，根据实验组CEA mRNA阳性表达强度作半定量分级，通过与不同病理因素比较，结果提示，随着胃癌侵袭深度增加、病期进展（PS因素）或因大体类型、浆膜类型不同，其95%可信区间增加且无交叉，CEA mRNA阳性级别呈现上升趋势( P＜0.05，表2)。

　　讨论

　　胃癌细胞侵犯浆膜或转移淋巴结被膜，脱落入腹腔，称之为腹膜亚临床转移。许多文献报道，PLC(+)与PLC(-)术后生存率有明显差异，大多数PLC(+)病例术后3年内死于临床腹膜转移^［1-3］。因此术前或术中行腹腔脱落癌细胞检测，进而采取有效的治疗手段，对提高胃癌根治术后生存率具有重要意义。国内外学者一直将传统的PLC方法作为检测腹膜亚临床转移的金标准，浆膜受侵的胃癌的PLC(+)率为40%～50%，但部分PLC(-)病例术后仍发生腹膜转移^［2］。本组PLC阳性率为38.9%，即使已发生肉眼腹膜转移(PS+)病例的阳性率仅为60%。说明传统的PLC方法尚缺乏敏感性,存在一定比率的假阴性。

　　CEA是一种检测消化道肿瘤特异性较高的肿瘤相关抗原。在封闭的腹腔内只有游离癌细胞可分泌CEA蛋白，白细胞可少量表达CEA相关基因^［1,7］。已有研究表明，采用腹腔冲洗液中p-CEA的定量检测，对预测腹膜转移的灵敏度优于PLC^［1］。本组p-CEA阳性率(38.1%)虽高于PLC(33.0%)，但无统计学意义。

　　近年来，随着分子生物学技术的进展，RT-PCR技术已被用于检测实体瘤微转移的病灶中特殊mRNA表达，通过对周围血、骨髓、淋巴结和脑脊液中微量转移瘤细胞的检测，显示了较高的灵敏性^［4-7］。我们采用该方法检测腹腔液中游离癌细胞CEA mRNA表达及半定量分析，结果表明，RT-PCR方法可检出10³最低数量级癌细胞的CEA mRNA的表达，其阳性率达56.3%，其中浆膜受侵(S+)病例为72.2%，伴有肉眼腹膜转移(P+)阳性率达90.0%，明显优于p-CEA和PLC，说明该方法具有较高的灵敏性。在同时检测的10例非癌病例冲洗液中细胞成分均未见CEA mRNA表达，显示了较好的特异性。

　　本组1例粘膜下早期胃癌（T₁）CEA mRNA表达阳性，而PLC和p-CEA均为阴性。分析癌细胞来源可能是经淋巴管或转移淋巴结被膜脱落所致，而少量癌细胞可被敏感性较高的RT-PCR方法检出。有关早期胃癌根治术后仍有1%左右发生腹膜转移的报告^［8］，可部分支持这一结果，但亦不排除RT-PCR检测过程中操作不当、开腹时皮肤上皮细胞污染或腹腔液中过量白细胞干扰造成的假阳性。对于后者，在PCR扩增过程中，如将退火温度严格控制在65℃～72℃，可解决这一问题^［9］。

　　本实验显示，腹腔液中CEA mRNA阳性表达级别随着侵袭深度和病期进展而增加，亦与大体类型和浆膜类型不同而差异有显著性，提示该方法适用于胃癌腹膜转移的预测或亚临床转移的筛检，尤其是浆膜受侵的进展期胃癌。但是，对于PLC或p-CEA阴性而CEA mRNA阳性病例，是否会发生腹膜转移，以及发生转移的时间，尚需密切随访观察。

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收稿日期：1999-02-12