三氧化二砷对人胃癌细胞诱导分化的实验

肿瘤 2000年第6期第20卷 基础研究

作者：顾琴龙　李宁丽　林言箴

单位：李宁丽（上海市免疫学研究所）；顾琴龙　林言箴（上海第二医科大学附属瑞金医院上海消化外科研究所　上海 200025）

关键词：三氧化二砷；胃肿瘤；肿瘤细胞，培养的；分化

　　摘要：目的　在三氧化二砷(As₂O₃)诱导凋亡的基础上，探讨低浓度As₂O₃对胃癌细胞诱导分化的作用。方法　以0.5 μmol的As₂O₃处理人胃癌细胞株SGC7901和MKN45，观察癌细胞增殖情况；经流式细胞仪检测细胞周期；用免疫组化法检测部分基因表达变化。结果　As₂O₃处理后：①癌细胞增殖减缓，传至16代后停止增殖；②48小时后开始，G₁/G₀期细胞比例增加，S期细胞比例减少；③p53和bcl-XL基因表达率降低，Bax基因表达率上升，bcl-2表达不改变。结论　低浓度As₂O₃有诱导胃癌细胞株分化作用，但不能完全逆转癌细胞的恶性生物学特性。

　　中图分类号：R735.2　　文献标识码：A　　文章编号：1000-7431(2000)06-0410-03

AN EXPERIMENT ON ARSENIC TRIOXIDE INDUCING DIFFERENTIATION OF GASTRIC CANCER CELL LINES

GU Qin-long　LI Ning-li　LIN Yan-zhen

　　Shanghai Ruijin Hospital,Shanghai Second University, Shanghai 200025, China

　　Abstract：Objective　To study whether arsenic trioxide will induce differentiation of gastric cancer cell.Methods　Human gastric cancer cell lines SGC7901 and MKN45 were treated with 0.5 μmol arsenic trioxide and cell proliferation ability was observed under flow cytometry assay and gene expression was detected by immunohistohemistry. Results　1.Arsenic trioxide reduced SGC 7901 proliferation rate. 2. Percentage of G₁/G₀ phase cells increased and percentage of S phase cells decreased after 48 hours. 3. Experssion rate of p53 and bel-XL descended. Expression rate of bax ascended and there was no change in bel-2　expression．Conclusion　Arsenic trioxide in low concentration can induce differentiation of gastric cancer cells but can not fully inverse its biological property.

　　Key words：　Arsenic troxide;　Gastric neoplasms;　Tumor cell cultured;　Differentiation

　　我国学者首先应用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒性细胞白血病(APL)获成功，又首先报道应用三氧化二砷(As₂O₃)治疗APL，对初治及ATRA治疗后复发病例均取得很高的缓解率。两者为APL治疗的里程碑^［1］。近年，上海血液学研究所首先对As₂O₃治疗APL的机理作了深入的研究，体外研究已证实，As₂O₃治疗APL的主要机理是诱导APL细胞的凋亡^［2］。有研究表明，As₂O₃还能诱导人胃癌细胞发生凋亡^［3］。此外，高浓度的As₂O₃诱导APL细胞凋亡，而低浓度的As₂O₃则可对APL细胞起诱导分化作用^［4，5］。本研究在诱导胃癌细胞凋亡的基础上，进一步探讨As₂O₃对人胃癌细胞株分化诱导作用。

　　材料与方法

　　一、As₂O₃

　　As₂O₃哈尔滨医大附一院制备。注射液浓度为5 mmol×10 ml，应用时以1640培养液稀释。

　　二、单克隆抗体

　　p53、Bax、bcl-2、bcl-XL均为小鼠抗人单克隆抗体(美国Pharmingen公司)，4℃保存，使用时根据要求稀释。

　　三、胃癌细胞株

　　人胃癌细胞株SGC7901和MKN45(中科院上海细胞生物所)，用含10 %小牛血清的1640(GIBICO)传代培养，细胞活力良好时使用。

　　四、细胞增殖力观察

　　于SGC7901细胞培养瓶内加入终浓度为0.5 μmol的As₂O₃，继续置培养箱内培养。每次扩增传代时再加入As₂O₃，使药物浓度维持在0.5 μmol不变。观察细胞增殖情况。

　　五、细胞周期检测

　　生长良好的胃癌细胞株中加入终浓度为0.5 μmol的As₂O₃，置培养箱培养，于24、48和72 h收集细胞。以胰蛋白酶消化，细胞离心沉淀后加8%乙醇PBS(0.2 mol/L，pH7.4)，4℃、30 min；洗涤后加100 μl PBS和100 μl RNase，37 ℃，15 min；加50 μg/200 ml碘化丙啶(PI)对细胞DNA荧光染色；最后经流式细胞仪测定，分析得到细胞周期各时相细胞的百分比。

　　六、基因检测

　　将无菌载玻片(1 cm×2.5 cm)置于SGC7901细胞培养瓶中，加入0.5 μmol的As₂O₃，同时设不加As₂O₃的对照组。继续培养至24、48、72 h及更长时间，取实验组与对照组细胞用免疫组织化学法检测4种基因表达。即将各组玻片取出，丙酮固定后，PBS洗涤，室温干燥。用0.3% H₂O₂中和内源性过氧化氢酶，用10%绵羊血清封闭无关抗原后，加一抗：分别为小鼠抗人p53、bax、bcl-2，bcl-XL单抗，4℃过夜，经PBS洗涤，加兔抗小鼠二抗，37 ℃、30 min湿盒中温育，加亲合素标记的辣根过氧化酶，最后加底物DAB显色。细胞被染成棕色者为基因表达阳性细胞。400倍显微镜下随机计数400个细胞，按阳性细胞所占百分比分为，-，阳性细胞数＜5%；+，阳性细胞数为5%～10%，++，阳性细胞数为10%～50%；+++，阳性细胞数＞50%。OLYMPUS显微镜下拍照记录。

　　结　　果

　　一、As₂O₃对SGC7901胃癌细胞增殖能力的影响

　　胃癌细胞株SGC7901在无药物作用时倍增时间为2天，即每2天传代(倍增)1次，无限制生长。在0.5 μmol的As₂O₃作用下，细胞传代至第8代(16天)后增殖减慢，每3天传代1次。第12代(28天)后，每4天传代1次。至第16代后细胞不贴壁，也不再生长，但镜下观察未见明显的细胞坏死。

　　二、As₂O₃对胃癌细胞周期变化的作用

　　在0.5 μmol的As₂O₃作用下，两种胃癌细胞的周期发生了变化(见表1)。As₂O₃作用24 h，细胞周期比例变化不明显，作用48 h后，细胞中G₁/G₀期比例明显增加，S期比例明显减少；作用72 h后，G₁/G₀期细胞比例继续增加，S期细胞比例继续减少。说明低浓度的As₂O₃能诱导胃癌细胞停留在G₁/G₀期，减少了S期细胞，从而使细胞增殖减慢。

　　三、低浓度As₂O₃对胃癌细胞凋亡的作用

　　在0.5 μmol的As₂O₃作用下，部分胃癌细胞发生凋亡，但凋亡发生率较低(见表2)，其作用远不如高浓度As₂O₃的作用^［3］。

表1　As₂O₃对胃癌细胞细胞周期的影响(%)

　　注：与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表2　低浓度As₂O₃对胃癌细胞凋亡诱导作用(%)

　　注：与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

　　四、低浓度As₂O₃对胃癌细胞基因表达的影响

　　低浓度As₂O₃处理后，SGC7901胃癌细胞p53、Bax、bcl-2、bcl-XL基因表达情况见表3。

表3　低浓度As₂O₃对SGC7901胃癌细胞基因表达的影响

　　胃癌细胞p53表达率较高，经As₂O₃处理后72 h内无变化，至第5天表达率下降。Bax在胃癌细胞表达率较低，As₂O₃处理24 h后表达率有所增高，第10天进一步增高。bcl-2表达在处理后无变化，而bcl-XL则由高表达率逐渐下降，至第10天后表达率进一步下降。说明低浓度As₂O₃在对胃癌细胞诱导分化过程中，改变了某些基因的表达。讨　　论

　　砷是砒霜的主要成分，一直被认为是致癌物质。自从张鹏等^［6］应用三氧化二砷(As₂O₃)治疗急性早幼粒白血病获得成功，尤其是对ATRA治疗复发耐药的病人治疗成功，开发了砷的新用途，上海血液学研究所对As₂O₃治疗APL的机理从分子生物学水平作了研究，提出其功效主要是诱导APL细胞凋亡，同时也证实As₂O₃能下调APL细胞bcl-2的表达，为As₂O₃治疗APL提出了科学依据^［2］。Zhang等^［7］报道As₂O₃也能诱导淋巴瘤细胞凋亡。我们的实验表明，As₂O₃对胃癌细胞也有凋亡诱导作用^［3］。Chen等^［4］的研究还发现，高剂量的As₂O₃诱导APL细胞凋亡，低剂量的As₂O₃则能诱导APL细胞分化。本研究应用低剂量As₂O₃(0.5 μmol)作用于人胃癌细胞株，证实低剂量As₂O₃确能对胃癌细胞起到分化诱导作用。虽然低剂量As₂O₃同时诱导胃癌细胞凋亡，但其凋亡率很低，而诱导分化作用则较明显。通过细胞周期检测，表明能改变癌细胞的细胞动力学，使静止期细胞明显增加，而增殖期细胞明显下降，这可能是低剂量As₂O₃抑制癌细胞增殖的机理之一。如我们在较长时间观察胃癌细胞扩增传代中所见，在As₂O₃作用下癌细胞增殖减慢，最后停止增殖。虽然其中可能发生细胞凋亡或死亡，但细胞增殖抑制是肯定的。

　　我们的研究揭示，低剂量As₂O₃使胃癌细胞的某些基因表达发生改变，如p53和bcl-XL基因表达率下降，Bax基因表达率上述，bcl-2基因则无变化。p53是一种抑癌基因，正常细胞均存在野生型p53，但基本不表达；突变型p53广泛存在于癌细胞，且有高表达率；将野生型p53导入肿瘤细胞可使之逆转^［8］。bcl-2是凋亡抑制基因，又称长寿基因，是维持癌细胞无限制生长的主要基因，75 %的胃癌组织中bcl-2表达阳性^［9］。bcl-XL的功能与bcl-2基本相同，也抑制癌细胞凋亡；而Bax则能抵消bcl-2的作用，促进癌细胞凋亡，此外野生型p53的存在也能诱导Bax的表达^［10］。本研究中发现，低剂量As₂O₃在抑制胃癌细胞生长时，降低了p53和bcl-XL的表达和增加了Bax的表达，说明胃癌细胞有被逆转的可能。而由于低剂量As₂O₃诱导的细胞凋亡率很低，可以解释对bcl-2表达几乎没有影响。As₂O₃作用后，基因表达改变的时间远迟于细胞周期的改变，而且癌细胞的p53表达仍然存在，推测可能在癌细胞动力学发生改变时，基因的变化较慢，即使基因有了变化，细胞还保留着恶性细胞的生物学特性。

　　总之，低剂量的As₂O₃能诱导胃癌细胞分化，是胃癌防治中值得探索的途径。但还不可能使其完全逆转。

　　顾琴龙，男，博士，副教授。

　　参考文献

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　　［3］顾琴龙，沈佰华，李宁丽，等.三氧化二砷诱发胃癌细胞株凋亡的初步研究〔J〕.中华消化杂志，1998，18：69

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　　［6］张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射治疗72例急性早幼粒白血病〔J〕.中华血液学杂志，1996，17：58

　　［7］Zhang W, Ohnishi K, Shigeno K, et al. The induction of apoptosis and cell cycle arrest by arsenic trioxide in lymphoid neoplasms〔J〕. Leukemia,1998,12:1383

　　［8］Suzanne J, Baker M, Eric R, et al. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53〔J〕. Science,1990,249:912

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(收稿日期：2000-05-24)