胃癌p53蛋白与PCNA的免疫组织化学研究
山西医药杂志 2000年第1期第29卷 论著
作者：常红霞 李亮成
单位：常红霞（山西省肿瘤医院 030013）；李亮成（山西省肿瘤医院 030013）
关键词：胃癌；p53蛋白；免疫组织化学；增殖细胞核抗原
摘 要：目的 探讨p53蛋白及PCNA与胃癌发生、发展的关系。方法 对39例进展期胃癌手术标本的肉眼可见的肿瘤组织、癌旁2 cm处及切缘“正常” 组织进行p53蛋白及PCNA免疫组化检则。结果 切缘“正常”组织、癌旁及 胃癌组织均有不同程度p53蛋白和PCNA的表达，p53阳性率逐渐升高，分别为10.3%(4/39)、 28.2%(11/39)及59.0%(23/39)，PCNA分级也逐渐升高，与p53呈正相关(P＜0.05 )。p53蛋白表达与肿瘤的浸润深度、血管和淋巴管浸润及淋巴结转移有关，p 53蛋白阳性的胃癌，其细胞增殖活性明显高于阴性者。结论 p53蛋白检测 有助于胃粘膜癌变倾向的判断和胃癌的早期诊断，对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一 定意义。联合检测p53和PCNA对胃癌恶性程度的判断有较高的价值。
Immunohistochemical study of p53 protein and PCNA in gastric carcinoma
Chang Hongxia,Li Liangcheng
（Shanxi Tumor Hospital,Tai yuan,030013,China）
Abstract：Objective To evaluate the significance of p53 p rotein and PCNA in occurrence and development of gastric cancer.Methods [ WTBZ]The expression of p53 and PCNA was detected immunohistochemically in 39 sur gically resected specimens including gastric carcinoma paired with its nearby pe riphery and “normal”gastric tissues.Results The positive rate of p53 immunoreactivity was 10.3%(4/39),28.2%(11/39) and 59.0%(23/39) respectively in “normal”gastric tissues,n earby periphery and gastric carcinoma.The expression of PCNA was correlated with p53 (P＜0.05).The lever of p53 was correlated with the dep th of invasion and lymphnode metastasis.Conclusion Determination of p53 immunohistochemically might be useful in early diagnosis,precarcinomatous s tudy and estimating surgically resected range of gastric cancer.p53 protein assa y combined with PCNA is significant for predicting vicious extent of gastric can cer.
Key words：Gastric carcinoma； p53 protein； Immunohisto chemistry； Proliferating cell nuclear antigen
野生型p53(wild type p53,WT p53)基因是肿瘤的抑制基因之一，当发生缺失或突变后可促使细胞无限制地生长，是肿瘤增生异常活跃的因素之一，对肿瘤的发生发展起重要的作用。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为一个内源性增殖细胞的标志物，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用，与胃癌组织的增长活性、胃癌的转移及预后关系密切。我们采用免疫组化法对胃癌p53蛋白的表达水平进行了分析，并同时检测了PCNA，以探讨p53蛋白和PCNA与胃癌发生、发展的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本：41例胃癌组织材料取自我院1997年5月至12月之手术标本。每一标本同时在肉眼可见的肿瘤组织、癌旁2 cm处及切缘“正常”组织取材三块，常规10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片5张，1张HE染色，4张免疫组化备染。根据全国胃癌协作组所制定的规范和TNM国际分期法进行详细病理学检查。
1.1.2 临床资料：41例中，除2例病理证实一侧切缘有残癌剔除外，39例用于研究。其中男性32例，女性7例，年龄40～73岁，平均58.4岁，所有病例术前均未进行化疗及放疗，全部为进展期胃癌。TNM分期：Ⅱ期14例，Ⅲa期12例，Ⅲb期8例，Ⅳ期5例。肿瘤与周围组织粘连14例，腹膜种植4例，淋巴结转移26例，肝转移1例。
1.2 主要试剂
鼠抗人p53单克隆抗体DO－7、鼠抗PCNA单克隆抗体OC－10及LSAB试剂盒均为DAKO公司产品， 购于上海基因有限公司。
1.3 方法
p53和PCNA表达的检测用LSAB免疫组化法。Ⅰ抗的工作浓度均为1∶100，Ⅱ抗、Ⅲ抗的工作浓度均为1∶400。
1.3.1 步骤：将每例标本的连续切片4张分别贴附在粘附剂处理的玻片上，2张用做p53和 PCNA免疫组化染色，2张用做空白对照。将切片置于盛有加热沸腾的0.4%柠檬酸缓冲液的高 压锅中，加阀煮沸2 min，以去除因甲醛固定和石蜡包埋对细胞核内p53抗原及PCNA造成的封 闭作用，从而提高检出率。在3%过氧化氢中孵育5 min，以消除内源性过氧化物酶活性。两 张切片分别滴加p53和PCNAⅠ抗，另两张滴加TBS液，室温下孵育30 min，然后滴加生物素标 记的兔抗鼠免疫球蛋白，室温下孵育30 min。再滴加结合有过氧化物酶的链球菌卵白素，室 温下孵育30 min。以上各步骤均以TBS液冲洗。最后滴加DAB显色液，镜下控制显色时间。蒸 馏水冲洗，终止反应。苏木素复染，逐级脱水，透明封片。
1.3.2 对照：以TBS置换Ⅰ抗作空白对照，已知阳性p53和PCNA胃癌切片作阳性对照。
1.3.3 结果判定：p53以细胞核呈清晰棕色为阳性，单纯细胞质着色或细胞核细胞质均无 着色为阴性。阳性病例又按切片中阳性细胞所占的百分比分为：(+)＜25%，(
)25%～50%， (
)＞50%。细胞增殖活性PCNA的定级：PCNA阳性着色表现为细胞核染成棕褐色，着色分布 不均，观察5个有代表性的高倍视野，计数每个高倍视野内100个肿瘤细胞中阳性细胞数，取 其平均值。分为Ⅰ～Ⅳ级，0～25%为Ⅰ级，26%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，＞76%为Ⅳ 级。
1.4 统计学处理
采用χ2检验、非独立分割χ2检验和Spearman等级相关分析。
2 结 果
2.1 p53、PCNA在胃癌组织中的表达
p53和PCNA在胃癌组织的表达明显高于癌旁组织和“正常”组(P＜0.01)，在癌旁 组的表达高于“正常”组(P＜0.05)，但在癌旁的轻、中度异型增生组间及“ 正常”组的正常粘膜与炎症上皮组间的表达无明显差异，见表1。p53染色局限于细胞核内， 细胞膜、细胞质不着色。PCNA也局限于细胞核内。在正常胃粘膜中，PCNA阳性细胞局限在腺 体下2/3区域，上部及上皮表面无PCNA表达，而在胃癌中，PCNA阳性细胞弥散分布。
表1 p53、PCNA在胃癌组织中的表达
| 组别 |
例
数 |
p53表达 |
PCNA |
| － |
＋ |
|
|
阳性率
(%) |
Ⅰ |
Ⅱ |
Ⅲ |
Ⅳ |
%1) |
| 胃癌组 |
39 |
16 |
14 |
9 |
0 |
59.02) |
6 |
8 |
12 |
13 |
64.12) |
| 癌旁组 |
39 |
28 |
9 |
2 |
0 |
28.23) |
20 |
8 |
8 |
3 |
28.23) |
| 轻度异型增生 |
11 |
10 |
1 |
0 |
0 |
9.1 |
7 |
3 |
1 |
0 |
9.1 |
| 中度异型增生 |
28 |
18 |
6 |
4 |
0 |
35.7 |
13 |
5 |
7 |
3 |
35.7 |
| “正常组” |
39 |
35 |
4 |
0 |
0 |
10.33) |
29 |
6 |
4 |
0 |
10.33) |
| 正常粘膜 |
5 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
| 炎症上皮 |
34 |
30 |
2 |
2 |
0 |
11.8 |
24 |
6 |
4 |
0 |
11.8 |
| 1) PCNAⅢ+Ⅳ的百分率。
2) 癌与癌旁及正常P＜0.01。
3) 正常组与癌旁组P＜0.05。 |
2.2 p53表达与临床病理特征的关系
从第13页表2～3中可见，p53表达与胃癌患者的性别、年龄、胃癌的部位、大体病理分型及 组织学分型无关。但与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移有关。第13页表4表明，1例肝转移以及 4例腹膜种植中的3例均有p53表达，但统计学上无差异。从第13页表5可见，有淋巴管及血管 内癌栓组p53表达明显高于无癌栓组。
表2 p53表达与临床病理特征关系
| 病理临床因素 |
例数 |
p53表达 |
P值 |
| - |
＋ |
|
|
阳性率(%) |
| 性别 |
|
|
|
|
|
|
|
| 男 |
32 |
13 |
11 |
8 |
0 |
59.4 |
＞0.0 5 |
| 女 |
7 |
3 |
3 |
1 |
0 |
57.1 |
| 年龄(岁) |
|
|
|
|
|
|
|
| ＜60 |
21 |
10 |
8 |
3 |
0 |
52.4 |
＞0.05 |
| ≥60 |
18 |
6 |
6 |
6 |
0 |
66.7 |
| 部位 |
|
|
|
|
|
|
|
| 贲门 |
23 |
10 |
8 |
5 |
0 |
56.5 |
＞0.05 |
| 胃体 |
5 |
2 |
2 |
1 |
0 |
60.0 |
| 胃窦 |
11 |
4 |
4 |
3 |
0 |
63.6 |
|
大体分型 |
|
|
|
|
|
|
|
| 溃疡型 |
28 |
12 |
11 |
5 |
0 |
57.1 |
＞ 0.05 |
| 浸润型 |
7 |
2 |
2 |
3 |
0 |
71.4 |
| 蕈伞型 |
4 |
2 |
1 |
1 |
0 |
50.0 |
| Borrman分型 |
|
|
|
|
|
|
|
| Ⅰ型 |
3 |
2 |
1 |
0 |
0 |
33.3 |
＞0 .05 |
| Ⅱ型 |
28 |
13 |
11 |
4 |
0 |
53.6 |
| Ⅲ型 |
4 |
1 |
1 |
2 |
0 |
75.0 |
| Ⅳ型 |
4 |
0 |
1 |
3 |
0 |
100.0 |
| Ming′s分型 |
|
|
|
|
|
|
|
| 膨胀型 |
5 |
2 |
2 |
1 |
0 |
60.0 |
＞0.05 |
| 浸润型 |
20 |
6 |
8 |
6 |
0 |
70.0 |
| 混合型 |
14 |
8 |
4 |
2 |
0 |
42.9 |
| 浸润深度 |
|
|
|
|
|
|
|
| pT1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
|
| pT2 |
6 |
5 |
1 |
0 |
0 |
16.7 |
|
| pT3 |
17 |
8 |
7 |
2 |
0 |
52.9 |
＜0.051) |
| pT4 |
16 |
3 |
6 |
7 |
0 |
81.3 |
＜0.011) |
| 淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
|
|
| N0 |
13 |
9 |
3 |
1 |
0 |
30.8 |
|
| N1 |
21 |
7 |
9 |
5 |
0 |
66.7 |
＜0.052) |
| N2 |
3 |
0 |
1 |
2 |
0 |
100.0 |
＜0.05 2) |
| N3 |
2 |
0 |
1 |
1 |
0 |
100.0 |
|
| 1) pT2分别与pT3、pT4之间的比较。
2) N0分别与N1、N2之间的比较。 |
表3 p53表达与组织学的关系
| 组织学分型 |
例数 |
p53表达 |
P值 |
| － |
＋ |
|
|
阳性率(%) |
| 管状腺癌 |
17 |
8 |
6 |
3 |
0 |
52.9 |
|
| 乳头状腺癌 |
2 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
|
| 低分化腺癌 |
12 |
3 |
5 |
4 |
0 |
75.0 |
＞0.05 |
| 粘液腺癌 |
5 |
2 |
2 |
1 |
0 |
60.0 |
|
| 印戒细胞癌 |
2 |
0 |
1 |
1 |
0 |
100.0 |
|
| 鳞腺癌 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
|
表4 p53表达与腹膜种植及肝转移的关系
| 播散情况 |
例数 |
p53表达 |
P值 |
| － |
＋ |
|
|
阳性率(%) |
| 腹膜种植 P0 |
35 |
15 |
13 |
7 |
0 |
57.1 |
|
| P1 |
3 |
1 |
1 |
1 |
0 |
66.7 |
＞0.05 |
| P2 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
100.0 |
|
| 肝转移H0 |
38 |
16 |
14 |
8 |
0 |
37.9 |
|
| H1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0.0 |
＞0.05 |
| H2 |
1 |
0 |
0 |
1 |
0 |
100.0 |
|
表5 p53表达与癌栓的关系
| 癌栓部位 |
例数 |
p53表达 |
P值 |
| － |
＋ |
|
|
阳性率(%) |
| 淋巴管内癌栓 |
|
|
|
|
|
|
|
| 有 |
26 |
7 |
11 |
8 |
0 |
73.1 |
＜0.05 |
|
|
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