胃癌组织中p16蛋白和Ki-67抗原的表达及意义
山西医药杂志 2000年第2期第29卷 论著
作者：李晓丽 张健康 李亮成 徐大毅
单位：李晓丽（山西医科大学第一医院 030001）；张健康（山西医科大学第一医院 030001）；李亮成（山西医科大学第一医院 030001）；徐大毅（山西医科大学第一医院 030001）
关键词：胃肿瘤；p16蛋白；Ki-67抗原；免疫组织化学
摘 要：目的 探讨p16蛋白和Ki-67抗原在胃癌发生、发展中的作用。方法 应用免疫组织化学法检测p16和Ki-67在20例正常胃组织和60例胃癌组织中的表达。结果 胃癌组织中p16蛋白表达阳性率(48.9%)明显低于胃正常组织(90%)。p16蛋白表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及浆膜和浆膜外脏器的累及有关(P＜0.05)。Ki-67在胃癌组织中的标记阳性率明显高于胃正常组织(P＜0.05)，伴有淋巴结转移的胃癌组织Ki-67标记阳性率较高。p16蛋白表达与Ki-67分级呈明显负相关(P＜0.05)，p16阴性表达的细胞增生活性明显增高。结论 p16蛋白表达缺失及其引起的细胞周期调控失常在胃癌的发生、发展中起一定作用；p16蛋白的检测有助于估计胃癌患者的预后、指导临床治疗；联合检测p16和Ki-67对判断淋巴结转移的危险性具有较高的价值。
Significance of the expression of p16 protein and Ki-67 antigen in gastric carcinoma
Li Xiaoli Zhang Jiankang Li Liangcheng et al（The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan，030001,China）
Abstract：Objective To study the clinical significance of the p16 protein and Ki-67 antigen expression in the occurence and development of gastric carcinoma.Method By using immunohistochemical methods,we detected the expression of p16 protein and Ki-67 antigen in 20 cases of normal gastric tissue and 60 cases of gastric carcinoma.Results The positive rate of p16 protein in gastric carcinoma was lower than that in normal gastric tissue.The expression of p16 was related to the degree of tumor differentiation,lymph node metastasis and the depth of invasion.The positive rate of Ki-67 LI (labelling index) in gastric carcinoma was higher than that in normal gastric tissue,and the gastric carcinoma with lymth node metastasis had a still more expression of Ki-67.A negative correlation was found between the expression of p16 protein and the Ki-67 LI;the cell proliferative activity in gastric tumors with a negative p16 expression was significantly higher than that in those with a positive p16 expression.Conclusion Deletion of p16 gene and subsequent irregulation of cell cycle play an important role in the occurrence and development of gastric carcinoma.Detection of p16 protein will contribute to the prognosis and therapy of gastric neoplasm.Both p16 and Ki-67 may help to predict the possibility of lymth node metastasis in gastric carcinomas.
Key words：Gastric neoplasm; p16 protein; Ki-67 antigen; Immunohistochemistry
胃癌是一种严重威胁人类健康的疾病。研究发现，癌基因的激活和抑癌基因的失活在其发病中起一定作用，许多癌基因产物都是通过对细胞周期的调控而实现其组织代谢调节作用。
p16基因是一个参与细胞周期调控的抑癌基因，其编码的p16蛋白通过抑制细胞周期蛋白(cyclin D)/周期蛋白依赖性激酶(CDK)活性参与并调节细胞的增生，是细胞增生周期的关键性调节因子。Ki-67是一类与细胞周期相关的增生细胞核抗原，可准确地反映细胞增生活性，用于评价肿瘤生物学行为。我们应用免疫组织化学法检测p16和Ki-67在胃癌组织中的表达，以探讨p16和Ki-67与胃癌发生、发展的关系。
1 资料与方法
1.1 标本：选择山西医科大学第一医院病理科1997年1月至1998年10月经病理诊断的胃癌手术标本60例和正常胃组织20例。60例胃癌中，男37例，女23例，年龄30～74岁，平均52.7岁。高、中、低分化腺癌分别为13、7、25例，粘液腺癌13例，印戒细胞癌2例。伴淋巴结转移42例。所有标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4～5 μm连续切片，分别做常规HE染色及p16、Ki-67免疫组化染色。
1.2 试剂：鼠抗人p16单克隆抗体和鼠抗人Ki-67单克隆抗体以及S-P试剂盒系Zymed公司产品，购自北京中山生物制品有限公司。p16和Ki-67的工作浓度均为1∶100。
1.3 方法：采用S-P法(链菌素亲生物素-过氧化物酶法)。具体操作步骤按说明书进行。
1.4 对照：阳性对照为已知p16、Ki-67阳性的胃癌标本，以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。
1.5 结果判定：p16以细胞浆或细胞核染成棕黄色为阳性细胞。光镜下观察5～10个有代表性的高倍视野，按切片中阳性细胞所占的百分比分为4级：－(0)，＋(＜25%)，(26%～50%)，(＞50%)。Ki-67抗原阳性染色位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，Ki-67在所有病例中均有不同程度的表达，在胃癌组织中，Ki-67染色呈弥漫分布或呈灶状，而在胃正常组织中，阳性染色局限于粘膜层腺体颈部。Ki-67阳性结果根据Ki-67标记指数(Ki-67LI)分为四级。Ⅰ级(0～10%)，Ⅱ级(11%～20%)，Ⅲ级(21%～50%)，Ⅳ级(＞50%)。Ki-67LI=Ki-67阳性细胞数/100个细胞。
1.6 统计学处理：采用χ2检验、χ2分割法和等级相关分析。
2 结 果
2.1 p16、Ki-67在胃癌和胃正常组织的表达：见表1。
表1 p16、Ki-67在胃癌和胃正常组织的表达
| 组织类型 |
例数 |
p16蛋白表达 |
P值 |
Ki-67分级 |
P值 |
| － |
＋ |
阳性率(%) |
Ⅰ＋Ⅱ |
Ⅲ＋Ⅳ |
阳性率(%)1) |
| 胃癌组织
胃正常组织 |
60
20 |
31
2 |
29
18 |
48.9
90.0 |
＜0.05 |
26
19 |
44
1 |
56.7
5.0 |
＜0.05 |
| 1) Ki-67Ⅲ＋Ⅳ级的百分率 |
从表1可以看出，p16在胃癌组织中的表达明显低于胃正常组织(P＜0.05)，Ki-67在胃癌组织中的分级明显高于胃正常组织(P＜0.05)。
2.2 p16和Ki-67与胃癌临床病理特征的关系：见表2。
表2 p16和Ki-67与胃癌临床病理特征的关系
| 临床病理特征 |
例数 |
p16蛋白表达 |
P值 |
Ki-67分级 |
P值 |
| － |
＋ |
阳性率(%) |
Ⅰ＋Ⅱ |
Ⅲ＋Ⅳ |
阳性率(%)1) |
| 分化程度 |
| 高、中分化
低分化 |
20
40 |
6
25 |
14
15 |
70.0
37.5 |
＜0.05 |
10
16 |
10
24 |
50.0
60.0 |
＞0.05 |
| 淋巴结转移 |
| 无
有 |
18
42 |
5
26 |
13
16 |
72.2
38.1 |
＜0.05 |
12
14 |
6
28 |
33.3
66.7 |
＜0.05 |
| 侵及浆膜及浆膜外脏器 |
| 无
有 |
32
28 |
12
19 |
20
9 |
62.5
32.1 |
＜0.05 |
16
10 |
16
18 |
50.0
64.3 |
＞0.05 |
| 1) Ki-67Ⅲ＋Ⅳ级的百分率 |
研究表明，p16蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤位置、大体分型和组织学分型无关，但与肿瘤分化程度、淋巴结转移和浆膜及浆膜外脏器的累及有关。从表2可以看出分化程度低、有淋巴结转移和累及浆膜及浆膜外脏器的胃癌组织P16表达阳性率明显低于分化程度高、无淋巴结转移和未累及浆膜及浆膜外脏器组(P＜0.05)。Ki-67标记阳性率与分化程度和是否累及浆膜及浆膜外脏器无关，但与淋巴结转移有关，伴有淋巴结转移的胃癌组织Ki-67标记阳性率较高，与不伴淋巴结转移组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.3 p16蛋白表达与Ki-67分级的关系：见表3。
表3 p16蛋白表达与Ki-67分级的关系
| p16蛋白表达 |
例数 |
Ki-67分级 |
| Ⅰ |
Ⅱ |
Ⅲ |
Ⅳ |
| － |
31 |
2 |
6 |
15 |
8 |
| ＋ |
14 |
3 |
4 |
5 |
2 |
| |
11 |
2 |
6 |
2 |
1 |
| |
4 |
1 |
2 |
1 |
0 |
从表3可以看出，p16蛋白表达与Ki-67分级呈明显负相关(P＜0.05，r′s=-0.415)，p16阴性表达组，其细胞增生活性明显增高。3 讨 论
在细胞增生周期中，细胞周期的正常演进依赖于细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)对细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的正负调节作用而完成。当受到正向调节因子(cyclin D)激活时，则促进细胞周期进展；受到负向调节因子CKI激活时，则细胞增生受阻。
p16是特异的CDK4抑制蛋白，由3个外显子和2个内含子组成，定位于人类染色体9P21，长23 kb，编码分子量为16 000的蛋白质即p16蛋白。正常情况下，p16在G1期与cyclin D1竞争结合CDK4并特异抑制CDK4活性，从而阻止细胞尤其是带有损伤DNA的细胞进入S期，对细胞增生起负反馈调节作用；当p16基因发生缺失或突变不能正常表达时，其竞争结合CDK4、阻止细胞分裂的能力降低，则增生的细胞失去控制，向着癌变发展。
p16基因在多种人类肿瘤中存在缺失或突变。Marx［1］研究发现，其突变率为75%，超过了p53基因50%的突变率。因此，p16基因又称为多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS1)。IIivoyasu等［2］用DNA序列分析和PCR-SSCP技术研究发现食管癌和胃癌组织中均有较常见的p16基因同源性缺失。我们研究结果显示：p16在胃癌组织中的表达明显低于胃正常组织，这些结果说明p16表达缺失与胃癌的发生有一定关系。关于p16表达与肿瘤进展、转移及预后的关系，文献［3］认为p16基因表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及预后密切相关。我们研究发现，分化程度低、有淋巴结转移、癌肿侵及浆膜及浆膜外脏器的胃癌组织p16蛋白表达明显低于分化程度高、无淋巴结转移和未侵及浆膜及浆膜外脏器组。吕有勇［4］亦报道，p16基因的缺失多见于低分化、有淋巴结转移的进展期胃癌。这些结果提示，p16基因表达缺失及其引起的细胞周期调控失常对胃癌的发生、发展起重要作用。p16基因表达的检测有助于估计胃癌患者的预后，从而指导临床治疗。
Ki-67是存在于增生细胞核的一种非组蛋白核蛋白，定位于第10号染色体，由相对分子量345 000和395 000的两条多肽链组成。它在增生细胞的G1、S、G2、M期表达，细胞有丝分裂后该蛋白含量迅速减少，在G0期不表达。有研究表明［5］，Ki-67抗原表达可反映肿瘤细胞的增生活性，与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关。我们的研究结果显示Ki-67在胃癌组织中的标记阳性率明显高于胃正常组织(P＜0.05)，表明胃癌细胞增生活性高于正常胃组织。胃正常组织中虽然有Ki-67表达，但多为Ⅰ级和Ⅱ级，且阳性染色位于具潜在增生能力的胃粘膜腺体颈部，与文献［6］报道一致。Broll等［7］认为伴远处转移的胃癌组织其Ki-67LI高于无转移组，但Ki-67LI与组织分化程度和生存率无关。我们发现，Ki-67标记阳性率与胃癌组织分化程度和浸润深度无关，但与淋巴结转移有关。有淋巴结转移组Ki-67标记阳性率高于无转移组。卜献民等［8］对胰腺癌和壶腹癌的研究也得出相同的结论。这些结果提示，Ki-67表达不仅能反映肿瘤细胞的增生活性，还能反映肿瘤淋巴结转移的危险性。
我们还发现，p16阴性表达组Ki-67标记阳性率明显高于p16阳性表达组。这是由于p16基因表达缺失，降低了它对细胞增生的负反馈调节作用，细胞增生活性增强，Ki-67分级也相应增高，显示出p16表达与Ki-67表达之间明显的负相关性(P＜0.05)。
作者简介：李晓丽，女，1967年3月生，主治医师，山西医科大学第一医院，030001
参考文献：
1，Marx J.New tumor suppressor may rival p53.Science,1994,264:344-345
2，IIivoyasu I,IIiroki S,Yuii T,et al.Mutation frequency of the p16/CDKN2 gene in primary cancers in the upper digestive tract.Cancer Res,1995,55(15):3421-3423
3，Jon AR.Loss of expression of the p16/cyclin-dependent Ki inhibitor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumor progression.Cancer Res,1995,55:2713
4，吕有勇.多基因变异与胃粘膜细胞癌变的关系.中华消化杂志，1996，16(1)：9-13
5，Gerdes J.Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological diagnosis and prognostic evaluations in human malignances.Sem Cancer Biol,1990,99:101
6，Maria R,Leonor D,Dina L,et al.Ki-67 labelling index in gastric carcinomas:an immunohistochemical study using double staining for the evaluation of the proliferative activity of diffuse-type carcinomas.J Pathology,1997,182:62-67
7，Broll R,Mahlke C,Best R,et al.Assessment of the proliferation index in gastric carcinomas with the monoclonal antibody MIB1.J Cancer Res Clin Oncol,1998,124(1):49-54
8，卜献民，戴显华，马凯，等.胰腺癌和壶腹癌中p16蛋白及Ki-67的表达.华人消化杂志，1998，6(5)：415-417
收稿日期：1999-12-27
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