逆转录病毒载体介导的CD基因对小鼠胃癌的原位杀伤作用

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 论　著

作者：崔龙　林言箴　喻德洪　朱正纲　陈雪华　郁宝铭

单位：崔龙　喻德洪　200433　上海，第二军医大学附属长海医院普外科；林言箴　朱正纲　陈雪华　郁宝铭　上海第二医科大学附属瑞金医院外科

　　关键词： 胃肿瘤；自杀基因；逆转录病毒

　　【摘要】　目的　探讨自杀基因的旁观者效应及引发的抗肿瘤免疫对胃癌的治疗作用。方法　将含有CD基因的重组逆转录病毒载体pCD2在PA317细胞中进行包装后，收获病毒上清；将此上清直接注射接种于615小鼠皮下并已成瘤的MFC小鼠前胃癌的肿瘤部位，再腹腔给予前药5-FC进行治疗。治疗结束后，检测NK、LAK细胞活性以判断机体免疫活性。结果　在前药治疗阶段中，转CD基因肿瘤较未转基因肿瘤的生长明显受抑，且有部分肿瘤消失(P＜0.01，n=10)。在成瘤对照组中，NK、LAK活性受到抑制，低于正常对照组，而CD/5-FC组的NK、LAK活性明显增高。肿瘤消失小鼠在远离原肿瘤部位再接种MFC细胞，90天后均未见肿瘤生长且长期存活。结论　在胃癌肿瘤部位直接转导CD基因不仅可以对肿瘤产生强效的杀伤作用，由此引发的抗肿瘤免疫反应对阻止肿瘤复发有重要意义。

Insitu anti-tumor effect for stomach neoplasm implanted on 615 mice resulting from cytosine deaminase gene deliveried by retrovirial vector

CUI Ling, LIN Yanzhen, YU Dehong, et al.

　　Department of Surgery, Changhai Hospital of Shanghai Second Military Medical University, Shanghai 200433

　　【Abstract】 Objective To seek an effecfive way to kill gastric cancer cells directly involving bystander effect and succesive anti-tumor effect resulting from cytosine deaminase gene mediated by retroviral vector.Method The murine gastric cancer line MFC were injected s.c.into the flank of 615 mice. When tumors were palpable, 0.2ml retroviral supernatant containing pCD2 gene was directly transduced into tumors following administration of 5-FC for 3 weeks. At the end of treatment, mice were sacrifice and pathologic eximination was taken, and NK\, LAK activity of murine were examined.Results Profound antitumor effect was observed in tumors generated from MFC-CD(+) tumors when the animals were given 5-FC by i.p. The tumors generated from MFC cells had a histological pattern similar to that of untreated animals with few areas of detectable necrosis. In cotrast, the tumors under the treatment of 5-FC/CD had a large scale necrosis resions compared with that of untreated animals. It was noteworthy that a second attempt in tumor transplanttation of MFC cells were failed in any of the mice with tumor completely regression.Conclusion The improvement of the anti-tumor effect by directly transduction of CD gene in tumors rends a basis of further reserch to gastric carcinoma, and the anti-tumor immune effect resulting from suicide gene support the continued development of a clinical gene therapy to prevent reccurence of gastric carcinoma.

　　【Key words】 Stomach neoplasms Suicide gene Retrovirus

　　我们将MFC细胞接种到615小鼠皮下成瘤，利用逆转录病毒载体为介导直接将CD基因到成瘤部位，再腹腔给予前药5-FC，观察肿瘤生长受抑情况。

　　材料与方法

　　1. 目的基因、试剂、细胞及动物　重组逆转录病毒载体pCD2(由美国M.D.Anderson癌症中心Mullen博士提供)^［1］，脂质体LipofectAMIN\,G418\,DMEM(GIBICO公司)，5-FC(Sigma公司)，逆转录病毒包装细胞Psi-2、PA317细胞及NIH3T3细胞(ATCC)，小鼠前胃癌细胞株MFC(中科院基础研究所)，6周龄、雌性615小鼠(中科院肿瘤医院动物所)，按常规方法饲养。

　　2. 肿瘤模型的建立、基因转导及抑瘤实验　将5.0×10⁵MFC细胞接种到615小鼠右大腿外侧皮下，待肿瘤可扪及时测量肿瘤体积。当肿瘤直径为20mm时，将0.5ml含pCD2基因的上清分3点直接注射到肿瘤部位，连续注射2天。从转基因第4天开始，每日腹腔注射500mg/kg体重的5-FC，连续给药治疗30天，而对照组动物予以生理盐水治疗。治疗结束后将小鼠引颈处死，取下肿瘤标本称重后，以福马林脱水，石蜡包埋制作切片，H-E染色观察肿瘤病理学变化。采用计量资料t检验对数据进行统计学处理。

　　3. CD基因旁观者效应对再接种肿瘤的作用　在前药治疗结束后，选择肿瘤消失的动物，再将5.0×10⁵MFC细胞接种到小鼠左大腿外侧皮下，观察肿瘤生长情况。

　　4. NK和LAK细胞活性检测　NK和LAK细胞活性均采用LDH稀释法，各组小鼠均切取脾脏收集脾脏细胞，将3×10⁶脾细胞与3×10⁵ YAC-1细胞置于37℃培养2小时，测定NK细胞活性。将脾细胞置于含有2万IU mIL-2/ml的培养液中，37℃、体积分数为5%CO₂培养3天。取培养过的脾细胞3×10⁶与YAC-1细胞3×10⁵置于37℃培养4小时，测定LAK细胞活性。

　　结果

　　1. 逆转录病毒包装收获及病毒上清病毒滴度pCD2载体在包装细胞经包装细胞包装后的逆转录病毒滴度为1.7×10²CFU/L。

　　2. 前药抑瘤作用　将MFC细胞接种到615小鼠大腿外侧皮下后，5天后在注射部位均可见肿瘤生长。转基因成功后，予以前药5-FC进行抑瘤实验，治疗结束后，称取肿瘤重量：转CD基因肿瘤重量为(2.44±0.32)mg，其中有14只动物肿瘤完全消失。未转CD基因组肿瘤重量(7.14±0.10)g，二者结果比较差异有显著性(P＜0.01)。可以看出，转CD基因的MFC胃癌肿瘤在5-FC作用下生长明显受抑制，对照组肿瘤的生长未出现明显的影响。

　　3. CD基因旁观者效应对再接种肿瘤的作用　实验中发现，一旦肿瘤消退，未见有复发者；10只肿瘤消失小鼠在远离原肿瘤部位再接种MFC细胞，90天后均未见肿瘤形成。

　　4. 肿瘤病理学变化　在镜下对肿瘤切片观察发现，各对照组肿瘤组织中的肿瘤细胞大部分生长活跃，并可见核分裂相，肿瘤周围可见少量炎性细胞浸润；转CD基因的第1组肿瘤标本内发现肿瘤细胞明显减少，可见大片出血性坏死区，部分肿瘤细胞内有明显的空泡样变性；另外，肿瘤周围及瘤内可见大量的纤维细胞及淋巴细胞浸润。

　　5. NK和LAK细胞活性检测　在成瘤对照组中，NK活性受到抑制(0.48±0.02)，低于正常对照组(5.34±0.42，P＜0.01)；而CD/5-FC组的NK活性明显增高(12.24±3.56,P＜0.01)。在成瘤对照组中，LAK活性受到抑制(3.18±0.224)，低于正常对照组(6.44±0.32，P＜0.05)；而CD/5-FC组的LAK活性明显增高(10.74±2.61，P＜0.01)。

　　讨论

　　本研究结果发现，在肿瘤直径小于20mm范围内时进行转CD基因治疗的效果较好，大部分肿瘤可消失；但在肿瘤直径大于1cm再进行转CD基因治疗时，虽然可以使肿瘤生长受到抑制，肿瘤缩小并生存期延长，但要使肿瘤完全消失却很困难。究其原因可能有：(1)肿瘤直径大于1cm时，基因转导的数目相对减少，在前药作用下，只能使部分肿瘤被杀死。(2)肿瘤抵抗外来杀伤作用的主要能力之一是靠形成自身的完整血液供应体系，即所谓的“血瘤屏障”，在其内即为肿瘤微环境。肿瘤较大时，“血瘤屏障”形成较完整，自杀基因的杀伤作用的发挥即受到限制。(3)逆转录病毒上清的病毒滴度低，在肿瘤细胞数目增多时，转基因细胞比率相对下降。因此，有必要采用基因转染效率高的载体进行转基因治疗，可能会对较大肿瘤的治疗效果有所提高。

　　我们在本实验中发现，皮下接种MFC小鼠前胃癌肿瘤在直接转CD自杀基因进行治疗后肿瘤消失，在肿瘤原位再接种同样数量的MFC细胞后肿瘤90天都未形成。这个现象提示，自杀基因的肿瘤旁观者杀伤效应产生的抗肿瘤免疫作用并不是一过性的，其可以持续较长时间，很可能产生了抗肿瘤免疫记忆。这在临床上对于防止肿瘤切除后的复发是有重要意义的。

　　注：本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39600142)

　　参考文献

　　1　Mullen CA, Kilstrup M, Blaese RM. Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine: A negative selective system. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:33-37.

(收稿：1999-05-10)