细胞色素P450 2C19基因多态性与食管癌易感性的关系

　　中华医学遗传学杂志2000年第17卷第3期

赵筱萍　童跃峰　赵鲁杭　周翔　陈枢青

　　关键词：细胞色素P450；2C19基因多态性；食管癌

　　肿瘤的发生和发展是由多种遗传改变累积造成的，遗传改变包括癌基因、抑癌基因和肿瘤易患基因的异常等。食管癌是常见的恶性肿瘤之一，占恶性肿瘤死亡率第4位^［1］，其发病率和病因学在世界范围内存在着很大的地区性差异，至今尚未探明。对食管癌的分子生物学机理已做了广泛深入的研究，迄今已证实肿瘤易患基因CYP1A1、2E1等基因多态性均与食管癌的发生有不同程度的相关^［2，3］。我们通过对食管癌组及对照组CYP2C19等位基因进行基因分型，以阐明CYP2C19等位基因多态性与食管癌易感性的关系。

1　材料与方法

1.1　标本来源　50例食管癌患者来源于浙江省肿瘤医院、浙江大学医学院附属第一医院、附属邵逸夫医院临床确诊的食管癌手术患者；100名正常健康受试者来源于志愿献血者，年龄和吸烟状态与食管癌组基本相近。每位受试者抽静脉血2 ml，EDTA抗凝，用于提取DNA。

　　1.2　DNA提取　对Chen等^［4］的方法进行改进，提取EDTA抗凝血中白细胞的DNA。取2 ml外周血于7 ml的离心管中，加2 ml TKM1(内含10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，10 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L EDTA)和0.05 ml Igepal CA-630振摇直至Igepal全部溶解。4 ℃、3000 r/min条件下离心10 min。去上清液后，留下的沉淀用TKM1清洗，继续上述条件离心。倾去上清液，沉淀中加入0.32 ml TKM2(内含10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，10 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L EDTA，0.4 mol/L NaCl)，加10%SDS充分摇匀，放在55 ℃水浴约10 min，至沉淀全部溶解。用冰浴冷却，加0.12 ml NaCl后再水浴。4℃×10 000 r/min离心10 min，取上清液，加无水乙醇，摇晃试管至DNA析出，用玻棒转移DNA，并用70%乙醇清洗，把DNA悬浮于TE缓冲液中，4℃保存，备用。

　　1.3　CYP2C19基因分型　参照de Morais等^［5，6］的基因分型法，选择最佳扩增参数和酶切温度，利用PCR-RFLP法对CYP2C19等位基因进行分析^［7］。

2　结果

2.1　利用PCR-RFLP法对CYP2C19进行基因分型，电泳结果见图1，2。

　　图1　CYP2C19 m1基因分型结果　1、5：标准分子量DNA样品；2：CYP2C19 m1野生型纯合子(wt/wt)；3：CYP2C19 m1突变型杂合子(wt/m1)；4：CYP2C19 m1突变型纯合子(m1/m1)

　　图2　CYP2C19 m2基因分型结果　1、6、7：CYP2C19 m2突变型杂合子(wt/m2)；2、3、5：CYP2C19 m2野生型纯合子(wt/wt)；4：标准分子量DNA样品，未检测到CYP2C19 m2突变型纯合子

2.2　对100名健康受试者和50例食管癌患者进行CYP2C19基因分型，结果见表1，2。

表1　对照组和食管癌组CYP2C19各种基因型例数

　　χ²=8.13,P＜0.005；相对危险性(OR)=3.16；95%可信度(CI)：1.40～7.13

　　3　讨论

　　CYP2C19基因定位于染色体10q24，又称S-美芬妥英羟化酶^［8］。1993年，Wrighton等^［9］从人类肝脏分离出来的一种酶，被发现参与美芬妥英、奥美拉唑等十几种临床药物和一些外源性物质的代谢。美芬妥英羟化代谢在人群中有遗传多态性，羟化速度快者为快代谢者(EM)，羟化速度慢者为慢代谢者(PM)，EM有3种基因型，分别是wt/wt、wt/m1、wt/m2，PM也有3种基因型，分别是m1/m1、m1/m2、m2/m2。

　　1994年，de Morais等^［5，6］在日本美芬妥英慢代谢人群中发现了两个等位基因的突变位点，分别命名为CYP2C19m1和CYP2C19m2。CYP2C19m1是第5外显子上第681位碱基G→A发生单碱基突变引起，而CYP2C19m2是第4外显子上第636位碱基G→A单碱基突变引起，由此可见，CYP2C19m1和CYP2C19m2是两个互相独立的突变型等位基因，由于发生单碱基突变，导致其终产物没有催化活性，失去了对美芬妥英及其他物质的羟化代谢能力。

　　我们对100名健康对照和50例食管癌患者进行CYP2C19等位基因分析，结果表明：食管癌组S-美芬妥英慢代谢者的发生率为34.0%，较正常对照组14.0%增加了一倍多，两者具有极显著差异(χ²=8.13,P＜0.05)，说明S-美芬妥英慢代谢者与食管癌的发生具有相关性，PM发生食管癌的相对危险性(OR)为3.16，95%可信度(CI)：1.40～7.13。从而推测CYP2C19 PM参与了食管癌致癌物的灭活，至于具体参与哪些致癌物的灭活尚有待于进一步的研究。因此当CYP2C19酶活性降低时，这些致癌物在体内代谢减慢，从而导致其在体内堆积，增加了致癌物在体内的作用时间和数量，从而增加了食管癌的易感性。因此研究CYP2C19基因的多态性有利于发现肿瘤的高发人群，对肿瘤的早期预防和发病机理的研究均具有重要意义。

　　基金项目：浙江省自然科学基金(396473)

　　作者单位：赵筱萍（310006 杭州，浙江大学医学院生化教研室）

　　赵鲁杭（310006 杭州，浙江大学医学院生化教研室）

　　周翔（310006 杭州，浙江大学医学院生化教研室）

　　陈枢青（310006 杭州，浙江大学医学院生化教研室）

　　童跃峰（浙江省永康市第一人民医院)

　　通信作者：赵筱萍　现在310009 杭州，浙江省卫生学校生化教研室

参考文献

［1］李连弟，鲁风珠，张思维，等.中国恶性肿瘤死亡率20年变化趋势和近期预测分析.中华肿瘤杂志，1997，19∶3-9.

　　［2］Nimura Y, Yokoyama S, Fujimori M, et al. Genotyping of the CYP1A1 and GSTM1 genes in esophogeal in carcinoma patients with special reference to smoking. Cancer, 1997, 80∶852-857.

　　［3］林东昕，唐永明，彭琼，等.细胞色素P450 2E1和谷胱甘肽转硫酶P1基因与食管癌的易患性.中华肿瘤杂志，1998，20∶94-97.

　　［4］Chen S, Chou WH, Blouin RA, et al. The cytochrome P450 2D6 enzyme polymorphism:screening costs and influence on clinical outcomes in psychiatry. Clin Pharmacol Ther, 1996, 60∶522-534.

　　［5］de Morais SMF, Wickinson GR, Blaidell J, et al. The major genetic defect responsible for the polymorphism of S-mephenytoin in human. J Biol Chem, 1994, 269∶15149-15422.

　　［6］de Morais SMF, Wickinson GR, Blaidell J, et al. Identification of a new genetic defect responsible for the polymorphism of S-mephenytoin metabolism in Japanese. Mol Pharmacol, 1994, 46∶594-598.

　　［7］赵筱萍，赵鲁杭，陈枢青.100名健康人群CYP2C19基因型检测.浙江预防医学，1999，11∶17-19.

　　［8］Goldstein JA, Faletto MB, Romker GW, et al. Evidence that CYP2C19 is the major S-mephenytoin 4′-hydroxylase in humans. Biochemistry, 1994, 33∶1743-1752.

　　［9］Wrighton SA, Stevens JC, Becker GW, et al. Isolation and characterization of human liver cytochrome P450 2C19:correlation between 2C19 and S-mephenytoin 4′-hydroxylation. Arch Biochem Biophys, 1993, 306∶240-245.