食管癌标本中PCNA及CyclinD1蛋白表达与DNA含量同时检测的意义

中华放射肿瘤学杂志 2000年第2期第9卷 论　著

作者：祝淑钗　殷蔚伯　万钧

单位：祝淑钗　万钧（石家庄，河北医科大学第四医院放射治疗科　050011）；殷蔚伯（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科）

关键词：食管肿瘤；增殖细胞核抗原；周期素D1；DNA；预后

　　【摘要】　目的　探讨放射治疗前后PCNA、CyclinD1蛋白表达和DNA含量分型3项指标同时检测对食管癌预后的指导作用。方法　在本院接受术前放射治疗及根治性食管癌切除术的47例食管癌患者中男28例，女19例；单因素生存分析采用Kaplan-Meier方法并用Logrank检验，多因素分析用Cox逐步回归模型，预后指数模型对整组病例进行多因素综合分析。结果　传统预后因素(放射治疗后病理改变、T分期、N分期)和肿瘤细胞基因蛋白PCNA、CyclinD1、DNA含量均可作为食管癌术前放射治疗(预后生存)的独立预后因素，多因素分析显示出同样结果，预后指数模型更敏感地反映出不同亚组的生存情况。结论　除传统预后因素外，肿瘤细胞标志物PCNA、CyclinD1、DNA有可能成为评估食管癌预后的参考指标，预后指数与各种单因素比较能更准确地提示预后生存。

Impact of synthetical assay of tumor cell proliferating marked PCNA,CyclinD1 and DNA content on prognosis of esophageal carcinoma

ZHU Shuchai　 YIN Weibo　WAN Jun

　　（Department of Radiation Oncology , Fourth Hospital , Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China）

　　【Abstract】　Objective　To explore the prognostic value of PCNA, CyclinD1 protein expression and DNA content determination in the esophageal carcinoma biopsy or surgial specimens. 　Methods　From November 1979 to December 1996 ,47 patients were treated with preoperative radiation followed by radical esophagectomy. All cases were confirmed pathologically to have squamous cell carcinoma .Immunohistochemical PCNA and CyclinD1 stain was performed using the conventional SP method, and the DNA content was analyzed by automatic image analysis technology (AIAT）. Kaplan-Meier method was used in univariate analysis and the Logrank test to inspect into possible differences . Cox stepwise regression model and the prognosis index (PI) model were used in multivariate analysis for prognosis evaluation. 　Results　Although the verified prognostic factors radio-pathological change ,T stage and N stage having been of predictive value,the tumor cell proliferating marked PCNA ,CyclinD1 and the DNA content were demonstrated as independent prognostic factors for preoperative radiotherapy of esophageal carcinoma as well. The PI was correlative much strongly to the patients' survival in the various subgroups.　Conclusions　In our opinion, the tumor cell proliferating marked PCNA,CyclinD1 and DNA content are the endpoints in predicting the prognosis of esophageal carcinoma.

　　【Key words】　 Esophageal neoplasms; Proliferating cell nuclear antigen , CyclinD1 ,DNA; Prognosis

　　研究食管癌标本增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA )、周期素D1(CyclinD1)蛋白表达和DNA含量分型，分别探讨单因素和多因素对预后的影响，从而准确评估这些肿瘤生物标志物的实用价值。

　　1　材料与方法

　　1.1　一般资料： 1979年11月至1996年12月， 47例食管癌患者在本院接受术前放射治疗及根治性食管癌切除术, 男28 例，女19例，平均年龄52岁（33～74岁）。放射治疗前内窥镜活检标本和放射治疗后手术标本，均经病理证实为鳞状细胞癌，且每一标本都检测3项指标。

　　1.2　术前照射方法: 前后两野垂直照射，肿瘤剂量30～40Gy，15～20次，3～4周。放射治疗后20d行根治性食管癌切除术。

　　1.3　试剂及仪器: PCNA抗体即鼠抗人的PC10单克隆抗体 、CyclinD1单克隆抗体 、IgG羊抗鼠血清免疫球蛋白 及SP试剂盒均购于北京中山生物技术公司; 微波炉系浙江产YWY781B型医用微波炉。

　　1.4　实验方法:常规免疫组织化学SP法检测PCNA、CyclinD1蛋白表达^［1，2］ 。 Feulgen染色方法用于DNA含量的检测^［4］。

　　1. 5　计数方法:PCNA、CyclinD1阳性细胞计数分为4级和5级；将PCNA阳性细胞≤25%(+)者定为低表达，＞25%者定为高表达(++～++++);CyclinD1蛋白表达分为阴性、弱阳性和强阳性；自动化图像分析术（automatic image analysis technology, AIAT）分析100个肿瘤细胞核内DNA含量，同时检测20个淋巴细胞的DNA含量作为对照,计算DNA含量的平均百分比并给出含量分布的直方图和数据。

　　1.6　结果判定:根据DNA直方图上主峰位置和弥散程度将DNA分为4种类型^［3，4］。Ⅰ型：DNA主峰在2C区伴部分峰弥散至4C区以内；Ⅱ型：相对高的峰在3C～4C区，部分峰弥散不超过5C区；Ⅲ型：超过4C区较低的峰值伴5C区以上分布的细胞数＜20%；Ⅳ型：多个峰值弥散分布伴5C区以上分布的细胞数＞20%。放射治疗后病理改变分3级^［5，6］。1. 7 统计方法: 不同组间比较用χ²检验，生存率用Kaplan-Meier方法计算并用Logrank进行显著性检验，多因素分析采用Cox风险模型(统计软件SPSS 9.0 For Windows )。

　　2　结果

　　PCNA、CyclinD1蛋白阳性呈细胞核内弥散分布的棕黄色颗粒，CyclinD1有少部分在胞核周围的胞浆内着色；DNA含量较低者为Ⅰ型 和Ⅱ型，较高者为Ⅲ型和Ⅳ型。采用Kaplan-Meier方法分析单个因素对预后的影响（见表1），仅放射治疗后病理改变、T分期、N分期、放射治疗前CyclinD1蛋白表达和放射治疗后PCNA、CyclinD1蛋白表达、DNA含量对长期生存有影响。

　　采用Cox逐步回归模型对影响食管癌预后生存的这些有意义的指标进行多因素 分析，发现最有统计学意义者为放射治疗后PCNA蛋白表达和DNA含量分型，且多因素分析显示每一项指标对预后都有明显的影响，结果见表2。

　　根据预后指数模型计算公式，将对预后生存影响最小者定为0，其次为1，影响最大者定为2，以各影响因素分组值的权重乘以Cox逐步回归的变异系数（即β值），计算所得各数之和作为预后指数PI,见表3。根据整组病例PI值 的分布情况，将PI按＜2.0、2.0～5.0、5.0～7.0和＞7.0分为4个亚组，4个亚组的生存曲线见图1，图中显示出多个预后因素综合分析可更好地区分不同亚组的预后生存情况。

图1　PI值不同的4个亚组生存曲线

　　3　讨论

　　食管癌系本省高发肿瘤，放射治疗作为综合治疗的支柱在食管癌治疗中发挥着重要作用。传统预后因素与肿瘤细胞标志物结合分析，有可能为评估食管癌放射治疗预后提供可靠的指标和依据。PCNA和CyclinD1蛋白作为细胞周期调节蛋白，调控着细胞的增殖状态，参与肿瘤细胞的加速再增殖，可能与放射治疗后局部复发有关^［7］。多数研究表明，CyclinD1基因扩增和相关蛋白的过度表达与食管鳞状细胞癌预后有极其密切的关系^{［2，8，9］}。如Naiton等^［8］报道55例食管癌CyclinD1蛋白表达阳性率为38%,其5年生存率为7%，明显低于不表达者（59%）

　　（P＜0.01）。Ishikawa^［9］报道一组食管鳞癌CyclinD1蛋白表达,显示同样的结果。本研究显示,活检标本和手术标本检测的CyclinD1蛋白表达对预后均具有显著性影响，即高表达者预后非常差，Cox模型多因素分析也具有统计学的意义（表2），这与大多数报道一致。它很可能作为食管癌非常敏感的预后指标，尤其对仅能获得内窥镜活检标本的放射治疗，有可能成为重要的参考指标。PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助成分，参与细胞增殖和损伤后的修复。本研究显示活检标本PCNA蛋白表达对预后未见有统计学意义，但放射治疗使PCNA蛋白高表达由治疗前55.3%(26/47)升高到放射治疗后的63.8%(30/47)。进一步研究发现，放射治疗后PCNA蛋白高表达者预后非常差（表1，2），这与作者以前报道是一致的^［1］。因此，PCNA蛋白高表达有可能代表着放射治疗后肿瘤细胞加速再增殖的存在，与放射治疗后近期内局部复发有关。

　　细胞分裂的实质是DNA的复制，细胞核DNA含量的变化直接揭示肿瘤细胞增殖动力学的变化。自动化图像分析术检测肿瘤细胞DNA含量的多数报道显示，DNA 含量的高低与临床生存时间长短成反比。 如Minu等^［10］报道78例食管癌接受AIAT分析，显示DNA含量高者5年生存率为14%，明显低于DNA含量低者(57%)，且差异有显著性意义（P＜0.05）。Bottger等^［11］报道DNA超三倍体者5年生存率为0% ，而二倍体者5年生存率为70%。本研究结果显示放射治疗前DNA含量分型对预后并无明显的影响，可能与活检标本量太小，影响显微镜下计算机扫描的准确性有关。而手术标本DNA含量的高低与食管癌预后生存有着明显的相关性，单因素分析(表1)和多因素分析(表2)都肯定了这一点，与目前绝大多数报道是相符的。

　　Cox逐步回归模型多因素分析显示放射治疗后病理改变为Ⅲ级、手术标本为T₁，N₀，CyclinD1蛋白表达为阴性、放射治疗后PCNA蛋白低表达及DNA含量较低者，预后都明显好于对照组。全组病例按预后指数模型拟和成4个亚组，从图1很清楚地显示出，预后指数越高生存越差。尽管病例数较少，但差异具有显著性意义(P＜0.05)，说明用预后指数模型综合多个预后因素评估食管癌的预后生存是可靠的。

表1　不同预后因素与生存率的关系

表2　Cox逐步回归分析不同预后因素对生存的影响

表3　不同预后因素的预后指数(PI)计算模式