脆性组氨酸三联体基因与食管癌遗传易感性的关系初探
中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究
作者：李卫东 王秀琴 程贵余 郭慧琴 王兴元 李伟 张春林 张睿 吴日文
单位：100021 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室（李卫东、王秀琴、程贵余、郭慧琴、王兴元、李伟、张睿、吴）；山西阳泉市肿瘤研究所（张春林）
关键词： 食管肿瘤/遗传学；基因缺失；序列分析，DNA；FHIT基因；遗传易感性
【摘要】 目的 检测73对食管癌标本中脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad gene, FHIT）基因相关的多态性位点的杂合性丢失。方法 以RT-PCR和DNA序列分析，检测14例食管癌标本及2个食管癌细胞系中FHIT基因5′-UTR及编码区的缺失情况。结果 3p14.2的D31480、D3S1481、D3S1234位点有较高频率的杂合性丢失。在14例标本中，有9例发现FHIT cDNA的全部或部分丢失，其中7例存在外显子1～4的丢失，5例有外显子5～9（编码区）的丢失。在食管癌细胞系EC8733中发现了FHIT全基因的丢失。结论 FHIT基因的改变在食管癌的发生中是一种常见的遗传现象，但其是否就是食管癌的易感基因还需进一步探讨。
Association of fragile histidine triad gene (FHIT) with susceptibility to esophageal cancer. A preliminary study Li Weidong, Wang Xiuqin, Cheng Guiyu, et al. National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College Beijing 100021
【Abstract】 Objective To identify loss of heterozygosity(LOH) and homozygous deletion on loci of fragile histidine triad gene(FHIT).Methods Gene regions have been detected in 73 pairs of esophageal cancer samples using microsatellite DNA markers. Deletions of FHIT cDNA on 14 fresh esophageal cancer(EC) samples and 2 EC cell lines were screened by RT-PCR and DNA sequencing.Results High frequency of LOH was detected on loci D3S1480, D3S1481, D3S1234. Of 14 esophageal cancer samples 9(64.3%) had deletions of the FHIT gene， 7 of them were deletions in exon 1-4, and 5 of them were deletions in exon 5-9, the coding region. The whole FHIT gene was found deleted in an EC cell line, EC8733.Conclusion It is suggested that the FHIT gene may play an important role in the genesis of EC. However, further study is needed to ascertain whether FHIT gene is indeed an EC susceptibility gene.
【Subject words】 Esophageal neoplasms/genetics Gene deletion Sequence analysis, DNAFHIT gene Susceptibility
以往的细胞及分子遗传学研究表明，3号染色体短臂的改变是食管癌特异的遗传变化之一。自从Wang-Peng等［1］首先在肺癌中发现3p14.2的断裂以来，此位点在其他癌中的变化越来越得到重视。胡楠等［2］发现在食管癌患者及其家族成员的外周血中3p14.2是最常见的脆性位点，后来的杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)研究也在此区域发现了较高频率的丢失［3,4］。我们对24个微卫星位点的研究结果表明，FRA3B脆性位点附近的 D3S1480位点有30%的缺失［5］。Ohta等［6］在1996年发现了位于此处的FHIT基因，该基因覆盖FRA3B位点，总长500kb，共有10个外显子，cDNA全长1 095bp，从第5～9外显子为编码区，长500bp。已在肺癌和头颈部肿瘤中发现了较高频率的FHIT基因缺失和部分缺失，且以一个或数个外显子的丢失为主，点突变少见［7,8］。为了明确FHIT基因在食管癌遗传易感性中的作用，我们从该位点的LOH和纯合性丢失及在DNA和cDNA水平上对FHIT的缺失进行了研究。
材料与方法
73对食管癌标本和对应的外周血及手术切端正常组织取自中国医学科学院肿瘤医院、山西阳泉市肿瘤研究所和北京协和医院胸外科，所有标本均经病理组织学检查证实。其中男性54例，女性19例，年龄在34～74岁间。有5例患者有食管癌家族史。鳞癌64例，腺癌 6例，小细胞未分化癌3例。分化程度为：高分化18例，中分化40例，低分化15例。本组侵及贲门2例，出现淋巴结转移18例。14例新鲜食管癌组织取材后立即液氮保存，EC8712、EC8733细胞系为本室建立。
采用酚-氯仿-异戊醇法抽提DNA, 用TRIzol试剂（Gibco/BRL）提取总RNA。位于3p14.2的微卫星序列标志D3S1480、D3S1481、D3S1234、D3S1289按文献［5］的方法，进行PCR反应，8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果［9］。按照Ohta等［6］的文献设计3对FHIT基因cDNA引物，分别针对第1～4外显子（5′-UTR）、第5～9外显子和第 6外显子，序列见表1。根据扩增片段的大小、有无组合判断外显子缺失的范围，其中第6外显子的引物亦用来扩增DNA样品。取1 μg总RNA用SuperScript试剂盒进行逆转录反应；取1 μl cDNA，分别加FHIT cDNA外显子1～4、5～9或6的引物及actin引物50 pmol，镁离子浓度为1.5 mmol/L，2.5 μmol/L ,4×dNTPs，1U Taq DNA聚合酶。95℃预变性3分钟后，94℃50秒,55 ℃1分钟，72℃1分钟，33个循环后72℃延伸5分钟。
表1 FHIT基因引物序列
| 引物编号 |
引物序列 |
扩增片段 |
| 2645 |
5′-TCTGCTCTGTCCGGTCACA-3′ |
exon 1～4, |
| |
|
336bp |
| 2646 |
5′-TTTCAGAAGACTGCTACCTCTT-3′ |
| 2647 |
5′-TAGGGACATGTCGTTCAGATTTGG-3′ |
exon 5～9 |
| |
|
引物,445bp |
| 2648 |
5′-CTGTGTCACTGAAAGTAGACC-3′ |
| 2643 |
5′-ATGTCCTTGTGTGCCCGCT-3′ |
exon 6引物, |
| |
|
145bp |
| 2644 |
5′-CTGCATGGAAAAGGTGAGAGA-3′ |
| 2645+2648 |
exon 1～9, |
| |
800bp |
DNA序列分析：从聚丙烯酰胺凝胶中回收和再扩增RT-PCR产物，用USB Sequenase Ver 2.0测序试剂盒测定DNA序列。
结果
在3p14.2区域D3S1480、D3S1481、D3S1234处发现了较高频率的LOH。这3个位点分别有53，50和40个信息个体，其丢失频率分别为28.3%（15/53）、18.0%（9/50）和20.0%（8/40）。有1例标本在D3S1481位点出现了纯合性丢失，D3S1289缺失率较低，为12.1%(7/58)。
在14例新鲜食管癌标本中，有9例存在FHIT cDNA的异常，占64.3%。其中1～4外显子丢失 7例，有1例出现异常转录本；外显子5～9丢失 5例。EC8733细胞系出现FHIT全基因的丢失（表2）。
讨论
1.FHIT基因与3p14.2微卫星DNA标志缺失的关系：先前发现在肺癌(特别是小细胞肺癌)、肾细胞癌和食管癌等多种恶性肿瘤中，都存在3p14.2的改变，脆性部位FRA3B即位于FHIT基因第5外显子的端粒侧30kb处［10］。D3S1480和D3S1481分别位于家族性肾细胞癌断裂点t(3;8)的着丝粒侧和端粒侧［6］，两者相距小于0.5 cM。而D3S1234则在D3S1481的端粒侧4 cM处。t(3;8)断裂点位于FHIT基因第3，4外显子之间，D3S1234位于第8，9外显子之间。这样，D3S1480、D3S1481和D3S1234就可分别反映FHIT 5′UTR和编码区的情况。t(3;8)端粒侧的D3S1481处丢失较D3S1480少。结合FHIT cDNA检测的结果，5′UTR(exon1-4)的缺失较编码区多，与微卫星DNA检测的结果一致，提示该基因的缺失多集中于t(3;8)的着丝粒侧。
2.FHIT cDNA在食管癌组织和细胞系中的改变：据文献报道［7,8］，FHIT基因的改变多以外显子的丢失为主，RT-PCR检测多见cDNA的丢失或异常转录本。我们设计了3对FHIT基因cDNA的引物，通过不同的组合可分析出cDNA缺失的大致范围，其中第6外显子的引物还可用来检测DNA标本。在14例标本中，发现了9例FHIT基因cDNA的异常，说明FHIT基因的改变在食管癌的发生中是一种常见的遗传学事件。1～4外显子的丢失较编码区更为常见，这与微卫星LOH的结果是相符的。值得注意的是，无论在cDNA水平还是在DNA水平，均没
表2 食管癌标本及细胞系FHIT基因cDNA缺失情况
| 标本号 |
FHIT基因 |
|
| 1 |
2 |
3 |
4 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
8712 |
8733 |
| exon 1-4 |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
A |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
| exon 5-9 |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
|
| 全长 |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
A |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
注：A为异常转录本有在食管癌标本中发现第6外显子的丢失，而5～9外显子的丢失却相对常见。与全长（804bp）、6～9外显子(345bp)的扩增结果相比较，仅有1例有7～9外显子的丢失，表明第 5外显子的缺失在编码区中较为多见。在食管癌细胞系EC8733发现了FHIT全基因的丢失，我室萧枫等曾用染色体荧光原位杂交检测在该细胞系发现等臂染色体i(3)(p),结合我们的研究结果，很可能这种细胞遗传学的变化涉及FHIT基因。
由以上结果可以看出，FHIT基因的改变多在非编码区，而编码区的缺失又集中在第5外显子。5′-UTR和第5外显子的改变是FHIT基因丢失的两个“热点”区域。FRA3B脆性位点的改变影响到FHIT的第5外显子，而t(3;8)断裂点只影响5′非编码区，对FHIT基因的产物（特别是6～9外显子）有何影响？3p14.2的缺失、易位是否只影响到FHIT基因，该区域还有无其他抑癌基因，尚需进一步研究。
参考文献
1Wang Peng J, Bunn PA, Kao-Shan C S, et al. A nonrandom chromosomal abnormality, del 3p(14-23) in human small cell lung cancer(SCLC). Cancer Genet Cytogenet, 1982, 6:119-134.
2胡楠，王秀琴，吴, 等. 染色体脆性部位和肿瘤发生——70例肿瘤患者外周血染色体脆性部位的观察. 遗传与疾病，1985，2：135-137.
3萧广惠, 李万波, 黄建华. 食管癌的杂合性丢失. 科学通报, 1991, 36:1886-1889.
4Wang L, Li WD, Wang XQ, et al. Genetic alterations on chromosomes 3 and 9 of esophageal cancer tissues in China. Oncogene, 1996, 12:699-703.
5李卫东，王亮，王秀琴, 等. 食管癌染色体位点特异性的杂合性丢失和微卫星 DNA序列不稳定. 中华医学遗传学杂志，1996，13: 194-197.
6Ohta M, Inoue H, Cotticelli M, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancers. Cell, 1996, 84: 587-597.
7Sozzi G, Veronese M, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer. Cell,1996, 85: 17-26.
8Mao L, Fan YH, Lotan R, et al. Frequent abnormalities of FHIT, a candidate tumor suppressor gene, in head and neck cancer cell lines. Cancer Res, 1996, 56: 5128-5131.
9朱丹，王亮，吴. 应用PCR-SSCP银染技术检测食管癌p53基因点突变. 中华医学遗传学杂志, 1994，11：354-355.
10Zimonjic D B, Druck T, Ohta M, et al. Positions of chromosome 3p14.2 fragile sites (FRA3B) within FHIT gene. Cancer Res, 1997, 57:1166-1170.
(收稿：1997-05-30 修回：1997-11-27)
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