p16基因抑制食管癌细胞生长的研究

中华肿瘤杂志 1999年第3期第21卷 基础研究

作者：彭琼　金顺钱　陆士新　陈瑞红

单位：彭琼　300052　天津医科大学总医院神经研究所；金顺钱、陆士新(联系作者)、陈瑞红　中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所病因室

　　关键词： 食管肿瘤；p16基因；基因表达；基因转染

　　【摘要】　目的　探讨p16基因对食管癌细胞生长的抑制作用，为食管癌致癌机理的研究和基因治疗提供理论基础。方法　我们采用基因转染技术，将全长野生型p16 cDNA转染到经亚硝胺诱发的人胎儿食管癌细胞系中，该细胞内源性p16基因已发生纯合性缺失。结果　转染p16基因的食管癌细胞生长受到抑制，其在软琼脂上克隆形成能力降低了大约4倍。对细胞周期分析表明，处在G₀～G₁期的细胞由33.7%增加到68.6%。经Dot blot和Western blot杂交证实，有外源p16 mRNA及蛋白的表达，说明p16蛋白具有生长抑制功能，其作用是通过介导G₁阻止完成的。结论　野生型p16基因导入p16基因功能缺失的细胞，能恢复其抑制癌细胞生长的功能。

p16 gene suppresses growth of human esophageal carcinoma cells

　　PENG Qiong, JIN Shunqian^*, LU Shixin^*, et al.

　　【Abstract】　Objective　To explore the effect of p16 gene on the growth inhibition of esophageal carcinoma cell line NEC.Methods　The full length of wild-type p16 cDNA was transfected into the esophageal carcinoma cell line of human fetus induced by N-methyl-N-benzylnitrosamine (NMBzA). In these esophageal carcinoma cell, p16 gene was homozygously deleted.Results　Expression of exogenous p16 gene in NEC cells was identified by dot blot and Western blot analyses. The growth rate of NEC transfected with p16 gene (NEC-p16) was markedly suppressed. Colony formation in soft agar was also decreased significantly. Cell cycle analysis by flow cytometry showed that the number of cells in G₁-G₀ phase of NEC-p16 cells was significantly increased while cells in S and G₂+M phase was decreased compared to that of the control NEC cells.Conclusion　Transduction of wild type p16 gene into p16 gene-depleted esophageal cancer cells can restore its suppressive effect on cell growth by arrest of cell cycle at G₁ phase.

　　【Subject words】　Esophageal neoplasms　　p16 gene　　Gene expression　　Gene transfection

　　p16基因是一个多重肿瘤抑制基因，也是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4的抑制因子^［1］，参与对细胞周期的调控，在人类的多种肿瘤中常发现p16基因的缺失和突变^［1-5］。我们发现，在我国食管癌高发区的食管癌患者和甲基苄基亚硝胺(NMBzA)诱发的人食管上皮癌组织中，均存在p16基因的缺失和突变。为了进一步证实p16基因对人食管癌细胞的抑制作用，我们采用基因转染技术，将全长的野生型p16 cDNA转染到经亚硝胺诱发的人胎儿食管癌细胞系中，以研究其对食管癌细胞生长的影响。

　　材料与方法

　　1.质粒：pRC/CMV/p16真核表达载体由美国Sarrano博士惠赠，含Xho Ⅰ 960 bp的p16基因的插入序列。

　　2.食管癌细胞：亚硝胺诱发的人胎儿食管癌细胞系为我室建立。

　　3.细胞基因组DNA的提取：采用饱和酚抽提法^［6］。

　　4.引物：5′-GGCTCTACACAAGCTTCCTT-3′，5′-TGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′。

　　5.PCR扩增反应：25 μl的反应体系中含有DNA样品0.1～0.5 μg，10 mmol/L Tris-HCl (pH8)，1.5 mmol/L MgCl₂，0.001%明胶，0.05%Triton X-100，4种dNTP(各200 μmol/L)，2%DMSO，引物各10 pmol/L(p16外显子2)。95℃变性5分钟后，加1 U Taq DNA聚合酶，在DNA扩增仪上进行如下循环：95℃20秒，62℃ 20秒，72℃ 30秒，30个循环后，72℃再延长5分钟。

　　6.细胞对G418敏感剂量测定：常规消化传代培养的食管癌细胞于24孔板中，每孔接种10⁵细胞，加不同浓度的G418(从100～500 μg/ml)，在第14天使细胞全部死亡的浓度即为转化后最佳G418筛选浓度。

　　7.Lipofectamine介导的DNA转染：按照转染试剂盒说明操作(Gibco公司)。

　　8.MTT法(噻唑兰比色分析法)测定细胞存活率：肿瘤细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%。

　　9.软琼脂集落生长实验：集落生长按文献［7］操作，每60 mm²平皿接种3万细胞。

　　10.流式细胞仪测定细胞周期时相：贴壁培养细胞常规消化，使1×10⁶单细胞悬液经PBS洗涤2次，加70%乙醇充分固定细胞后，用RNase (10 mg/ml) 5 μl 37℃消化1小时，经尼龙膜过滤，PI(100 μg/ml)50 μl染色30分钟，以流式细胞仪(Epics ellte esp, Coulter)检测。

　　11.RNA的斑点杂交：杂交法按文献［6］操作。

　　12.固定化蛋白质的免疫学测定：Western印记法：待测细胞经裂解缓冲液(1 ml/90 mm²平皿)充分裂解后，采用双辛可宁酸蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，取30 μg待测样品置于15%聚丙烯酰胺凝胶上，电泳数小时后电转移到硝酸纤维膜上，加入特异性鼠抗人p16单克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜。次日分别与生物素化的抗鼠IgG及链霉素一亲合素复合物(1∶1 000)反应，经二氨基联苯胺(DAB)显色至清晰的蛋白条带出现。

　　结果

　　1.食管癌细胞(NEC)中外源p16基因表达的分析：分别用质粒pRC/p16(含CMV启动子、野生型p16 cDNA和SV40 polyA信号)和空载体PCMV-polyA(含CMV启动子、SV40 polyA信号、无p16 cDNA)在Lipofectamine介导下转染NEC细胞，该细胞内源性p16基因已发生纯合性缺失，经G418(400 μg/ml)筛选10天获G418抗性克隆。转染p16基因的NEC细胞(NEC-p16)克隆数量明显低于转染空载体细胞(NEC-neo)的克隆数量(表1)，较NEC-neo组51.8%减少。RNA Dot blot杂交结果表明，NEC-p16细胞内p16 mRNA表达信号明显高于NEC及NEC-neo细胞杂交背景(图1)。经激光密度扫描所得面积积分值显示，NEC-p16细胞其表达量分别是NEC及NEC-neo细胞的8倍及3倍(P＜0.01，0.05)，表明有外源p16 mRNA的表达。

　　1：无RNA的空白对照； 2：NEC细胞； 3，4：转染p16基因后获得的两个不同克隆； 5：转染空载体的对照组

图1　RNA Dot blot杂交分析p16基因的mRNA表达

表1　NEC细胞中p16 mRNA的表达(±s)

　　a：与NEC组相比，P＜0.01； b:与NEC组相比，P＜0.05； c：与NEC-neo相比，P＜0.05　　2.外源p16蛋白表达确定：分别提取NEC、NEC-neo、NEC-p16细胞的蛋白质进行PAGE电泳，Western blot分析显示，NEC-p16细胞在1.6 kd处出现一条蛋白带，而NEC和NEC-neo细胞未见有特异的蛋白带，说明NEC-p16细胞有外源p16蛋白的表达。

　　3.外源p16蛋白对NEC细胞生长的抑制作用：MTT测定的细胞生长率表明，p16蛋白的表达抑制了NEC-p16细胞的生长，且其对细胞生长的抑制逐渐增加，说明NEC-p16细胞已改变了原来指数生长状态。在第5天时，细胞生长抑制率达58.3%。

　　4.pRC/p16对细胞周期的作用：收获G418筛选的抗性克隆细胞，经流式细胞仪分析显示，在NEC-p16细胞组中，68.6%的细胞处在G₀～G₁期，18.1%的细胞在S期；而在对照的NEC组中，只有33.7%细胞处在G₀～G₁期，45.5%的细胞在S期。此外，NEC及NEC-p16组的细胞在G₂～M期的百分率分别是13.3%和20.4%，说明转染p16基因后产生了G₁阻止作用。

　　5.软琼脂集落形成：如表2所示，G418筛选10天后，NEC-p16抗性克隆明显少于NEC-neo细胞，为NEC-neo细胞的48.2%；在软琼脂上，其克隆形成能力也明显降低了大约4倍，且所形成的克隆也小于对照组。

表2　转染p16基因后NEC细胞克隆形成(±s)

　　讨论

　　我们经PCR扩增分析发现，经亚硝胺诱发的人胎儿食道上皮癌中p16基因为纯合性缺失，用Western blot分析也证实无p16蛋白的表达。以此为模型，我们将含有p16 cDNA全长的pRC表达载体，在lipofectamine介导下，转入NMBzA诱发的NEC细胞，经G418筛选10天获阳性克隆，发现转染p16的NEC细胞其克隆数量明显少于对照组及空载体组。经生长曲线检测的细胞生长率发现，NEC-p16细胞生长明显受到抑制，抑制率达到58.3%，说明p16基因已成功的导入，并发挥了对细胞生长的抑制作用。同时用Western blot方法，我们也证实NEC-p16细胞有16 000的外源蛋白表达，而对照组及空载体未见到有特异的蛋白带。此外，我们还观察到转染了p16基因的NEC细胞不仅细胞生长速度减慢，而且在软琼脂中形成的克隆数量明显少于对照组，克隆体积也小。G418筛选的阳性克隆细胞生长表现为向外膨胀性生长的良性特征，支持p16基因的蛋白产物具有生长抑制功能的观点，也支持p16基因在食管癌中是作为一种肿瘤抑制基因而发挥其作用的论点。

　　p16基因是CDK4的抑制因子，CDK4，6与cyclin D1结合形成复合物之后能使细胞周期进入G₁期；而p16蛋白能与CDK4，6-Cyclin D1复合物结合，使其失去激酶活性，不使Rb/E2F复合物磷酸化。因此，E2F转录因子不能被释放，DNA合成也就不能启动，从而使细胞生长停滞於G₁期，细胞的生长受到抑制。在我们的实验中也证实了这一点。当NEC细胞转染p16基因后，NEC-p16细胞在G₁期细胞达68.6%，而在S期只有18.1%，表明转染p16基因后产生了G₁阻止作用，使NEC细胞生长减慢。

　　我们的实验结果与一些学者的研究报道相似。Okamoto等^［8］研究发现，将p16基因cDNA表达载体转染肿瘤细胞可以抑制肿瘤细胞的克隆形成效率，而且有p16基因表达的肿瘤细胞其体外继续传代受到抑制。Jin等将野生型p16基因连接于一个腺病毒衍生的基因转移系统，并将其导入无p16基因表达的肺癌细胞系中，结果证实，导入的p16基因的表达可制止肿瘤细胞进入S期，并抑制肿瘤细胞体内及体外的增殖。Arap等^［9］应用基因转移技术研究了p16基因cDNA的生长抑制功能，发现将全长p16基因cDNA导入无p16基因的人类胶质瘤细胞中可明显抑制其生长，但对于有内在的野生型p16基因的细胞无明显作用。Fueyo用腺病毒介导p16/CDKN2转染胶质瘤细胞，引起该细胞生长的停止，并改善了被转染细胞的表型。总之，我们认为，p16基因的失活在食管癌发生进程中是一个重要因素，野生型p16的恢复将有可能成为临床基因治疗的又一新靶点。

　　本课题受国家“八五”科技攻关基金资助

　　参考文献

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　　5　Okamoto A, Hussain SP, Hagiwara K, et al. Mutation in the p16^ink4/MTS1/CDKN2,p15^ink4B/MTS2, and p18 gene in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res, 1995,55：1448-1451.

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　　7　鄂征主编.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1989.156-158.

　　8　Okamoto A, Demetrick DJ, Spollare EA, et al. Mutations and altered expression of p16^ink4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91：11045-11049.

　　9　Arap W, Nishikawa R, Furnari FB, et al. Replacement of the p16/CDKN2 gene suppresses human glioma cell growth. Cancer Res, 1995,55：1351-1354.

收稿：1998-07-16　　修回：1998-09-14