食管癌、贲门癌患者血清和组织一氧化氮生成水平变化的初步研究

江苏医药 2000年第3期第26卷 临床研究

作者：史宏灿　石维平　束余声　陆世春　王晓玲　张玲

单位：史宏灿(扬州大学医学院附属医院　225001)； 石维平(扬州大学医学院附属医院　225001)； 束余声(扬州大学医学院附属医院　225001)； 陆世春(扬州大学医学院附属医院　225001)； 王晓玲(扬州大学医学院附属医院　225001)； 张玲(扬州大学医学院附属医院　225001)

关键词：食管癌；贲门癌；一氧化氮；免疫抑制

　　摘　要：目的　探讨内源性一氧化氮（NO）与食管癌、贲门癌的关系。方法　应用硝酸还原酶法测定50例食管癌、贲门癌患者血清、癌组织、癌旁组织中NO的生成量。结果　恶性肿瘤患者血清NO水平显著低于正常对照组，术后NO的恢复存在个体间差异，总体上与术前相比差异无显著性；癌旁组织匀浆NO含量高于癌组织NO含量，在癌侵及肌层时更为明显，侵及全层及外侵后，则两者间未见差异。结论　恶性肿瘤患者的免疫抑制是肿瘤源性的。NO水平变化为如何改善肿瘤病人全身、局部免疫抑制状态提供了有益的免疫学依据。

　　一氧化氮（NO）作为生物体内一种结构最简单、反应性极强的多功能信息分子，在人体正常生理功能调节和许多疾病的发生、发展中起着很重要的作用。本文通过对食管癌、贲门癌患者血清、组织中NO生成水平进行检测，探讨NO与恶性肿瘤所致免疫抑制状态之间的关系，为改善肿瘤病人的免疫抑制状态提供理论依据。

　　材料和方法

　　一、研究对象

　　50例食管癌、贲门癌患者均经手术和病理证实，其中食管癌32例，贲门癌18例；男30例，女20例；年龄36～72岁，平均54岁；食管癌均为鳞癌，贲门癌均为腺癌。食管癌按UICC国际TNM标准（1987）分期，贲门癌按1985年经UICC和AJC共同召开的国际会议上通过的目前试行胃癌TNM分期法。50例中，Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期15例。所有患者围手术期均未使用化疗、放疗、含氮 药物及免疫治疗。正常血清对照组为30例志愿献血者，男18例，女12例，年龄20～60岁，平均41岁。

　　二、标本采集

　　1．血标本采集

　　健康献血者在献血的同时留取血标本（采血一次）。肿瘤组病人于手术前一周内晨抽取空腹静脉血2ml，离心，静止，吸取上清置－20℃冰箱保存备用。所有行根治手术且无并发症者于术后10天同法采血及处理，供血清NO含量测定。

　　2．组织匀浆制备

　　手术标本离体后，切取等量的无明显出血、坏死的癌灶和癌旁组织各400mg，去污、剪碎、匀浆管研磨、超声波粉碎，经离心后吸取匀浆上清0.1ml，进行组织中NO含量测定。

　　三、检测方法

　　内源性NO化学性质活泼，半衰期极短，难以直接检测。NO在体内迅速氧化生成稳定的无生物活性的代谢产物亚硝酸盐（NO^－₂）和硝酸盐（NO^－₃），NO^－₂＋NO^－₃浓度之和准确代表了体内NO水平，因此NO^－₂／NO^－₃水平被用作为体内NO产生的指标^［1］。本研究采用硝酸还原酶特异性地将NO^－₃还原为NO^－₂，利用NO^－₂与Griess试剂呈色反应建立测定方法，通过显色深浅测定其浓度的高低，结果以μmol／L表示。NO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，采用上海分析仪器厂752C型分光光度计进行测定。

　　四、统计学处理

　　数据用表示，t检验。

　　结果

　　一、肿瘤组手术前后血清NO水平比较

　　肿瘤组患者术前血清NO水平（55.33±27.56）显著低于正常对照组（74.34±14.98），差异具有显著性（P＜0.05）。根治手术后NO水平仍有一定程度的下降（45.61±22.71），但与术前相比差异不具显著性（P＞0.05）。血清NO水平与癌浸润深度、病理类型、细胞分化程度、有无淋巴结转移及临床分期均未显示统计学差异（P＞0.05）。

　　二、癌及癌旁组织匀浆NO水平比较

　　癌旁组织匀浆NO含量高于癌组织（P＜0.05），在癌侵及肌层时两者间相差更为明显，差异具有显著性（P＜0.001），侵及全层及外侵后，则两者间无差异。癌及癌旁NO含量变化与肿瘤生长部位、细胞分化程度、有无淋巴结转移无关（P＞0.05）（见表1）。

表1　癌及癌旁组织匀浆NO含量测定值

　　讨论　　人体内源性NO是由NO合酶（NO synthase，NOS）催化L-精氨酸而生成的。NOS广泛分布于食管、胃肠道，其活性及分布异常可能与某些疾病的病理过程有关^［2，3］。干扰素（IFN-γ）可与第二信使（肿瘤坏死因子INF-α、白细胞介素2、脂多糖LPS等）协同诱导巨噬细胞（MΦ）、内皮细胞合成大量的NO来介导MΦ的杀瘤和内皮细胞的溶瘤作用。本研究结果显示，食管癌、贲门癌患者术前血清NO水平明显低于正常对照组，而与癌浸润深度、病理类型、细胞分化程度及有无淋巴结转移无关。但也观察到，一些较早期的患者血清NO维持在较高水平，推测可能由于肿瘤刺激MΦ等免疫细胞，经某些细胞因子诱导和活化产生了大量的NO，介导MΦ原始的抗肿瘤作用。MΦ杀伤肿瘤细胞的能力与其产生的NO呈正相关。而一些中晚期患者血清NO明显下降，分析可能与肿瘤晚期机体免疫功能显著下降，免疫活性细胞功能高度受抑以及由肿瘤细胞产生的可溶性NOS抑制因子大量释放有关^［4］。尽管NO水平下降与临床分期在本资料中未显示统计学差异，但这是一个有意义的现象，值得进一步研究。Sotomayor^［5］观察到荷瘤小鼠腹腔MΦ对肿瘤靶细胞毒性作用明显下降，并伴有MΦ产生NO水平降低，认为荷瘤动物MΦ细胞毒作用下降中起关键作用的是NO的产生或释放降低。在肿瘤进展期，肿瘤可通过MΦ、内皮细胞等的NO生成及释放来抑制T淋巴细胞的增殖和B淋巴细胞抗体的生成，损伤MΦ的细胞毒性效应以及降低血管内皮细胞的防御功能，对机体抵抗肿瘤的生长、浸润和转移产生负性影响，成为恶性肿瘤实现免疫逃逸的又一重要机制。在本研究中，我们还发现癌组织匀浆中NO含量明显低于癌旁组织，分析可能与癌组织中NOS活性表达处于抑制或低下有关。Chhatwal^［6］对人结肠癌NOS表达进行检测，发现癌组织NOS活性明显低于癌旁粘膜组织及正常组织。这一结论有助于我们对实验结果的进一步阐释。通过对实验数据的进一步分析，我们发现肿瘤侵及肌层时，癌及癌旁NO含量相差更为明显，而一旦侵及全层或外侵后，两者间则无差异，对此发生机制目前尚无适当的解释，需扩大病例深入研究。

　　围术期患者免疫功能变化很复杂，干扰因素较多。手术及麻醉是一种免疫损伤过程，干扰了神经-内分泌-免疫网络。创伤性刺激使血肾上腺皮质激素分泌升高，通过抑制NOS活性表达来减少NO的生成，这可能是术后NO改变不一致，总体上仍有一定程度下降的一个重要因素。当然肿瘤切除至检测时间较短，病例的选择以及个体间差异也是一个不容忽视的因素。恶性肿瘤的免疫抑制是肿瘤源性的，根治切除肿瘤是机体免疫功能全面恢复的先决条件。手术的作用具有双重性。术后免疫功能呈现一个暂时抑制到逐渐恢复的过程。我们认为术后不应过早应用可能抑制机体免疫功能的药物，而应考虑辅以免疫调节剂或NOS活性调节药物，适当提高组织或细胞内NO水平，增强MΦ等免疫细胞的抗瘤效应，这对防止残留肿瘤细胞的生长、浸润、转移乃至复发具有重要意义。

　　（本研究承蒙本院胸外科肖文恩、戴家麟、王佑主任的悉心指导，特此致谢!）■

　　参考文献：

　　［1］Ochoa MD，Anthony O，Udekwu MD，et al．Nitrogen oxide levels in patients after trauma and during sepsis．Ann Surg，1991，214：621-626．

　　［2］Feldman MJ，Morris GP，Dinda PK，et al．Mast cell mediated acidinduced augmentation of opossum esophageal blood flow via histamine and nitric oxide．Gastroenterology，1996，110：121-128．

　　［3］Tripp MA，Tepperman BL．Role of calcium in nitric oxide-mediated injury to rat gastric mucosal cells．Gastroenterology，1996，111：65-72．

　　［4］Calderon C，Zhi-Heng Huang，Gage DA，et al．Isolation of a nitric oxide inhibition from mammary tumor cells and its characterization as phosphatidyl serine．J Exp Med，1994，180：945-958．

　　［5］Sotomayor EM，Dinapoli MR，Calderon C，et al．Decreased macrophage-mediated cytitoxicity in mammary-tumor-bearing mice is related to alteration of nitric oxide production and／or release．Int J Cancer，1995，60：660-667．

　　［6］Chhatwal VJS，Ngoi SS，Chan STF，et al．Aberrant expression of nitric oxide synthase in human polyps neoplastic colonic mucosa and surrounding peritumoral normal mucosa．Carcinogesis，1994，15：2081-2085．

收稿日期：1999-04-04

修稿日期：1999-08-14