生物学标志物在大肠癌化学预防中的应用研究

卫生研究 2000年第2期第29卷 达能营养中心青年科学工作者论坛

作者：贾旭东　韩驰

单位：贾旭东（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050）；韩驰（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050）

关键词：生物学标志物；大肠癌；化学预防

　　摘　要：建立大鼠大肠癌动物模型，选用一系列生物学标志物，观察茶对大肠癌的化学预防效果。结果表明，与阳性对照组相比，在16和32周，绿茶组和茶色素组动物大肠细胞增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数和核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)颗粒数目显著减少，ras-p21蛋白表达也降低(P＜0.01)；而且，绿茶和茶色素还抑制了Bcl-2蛋白的表达，诱导了Bax蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01)。本研究为PCNA、AgNORs、Bcl-2蛋白、Bax蛋白以及ras-p21蛋白等作为大肠癌人群化学预防研究的生物学标志物的可行性和有效性提供了依据。

　　分类号：R730.1　R735.34　S571.1　文献标识码：B

　　文章编号：1000-8020(2000)02-0109-03

Biomarkers in the studies on chemoprevention of colorectal cancer

Jia Xudong　Han Chi

　　（Institute of Nutrition and Food Hygiene，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing　100050，China）

　　Abstract：The present study was to investigate the chemopreventive effects of tea on colorectal cancer with a series of biomarkers.The results showed that the number of silver-stained nucleolar organizer dots per nucleus(AgNORs)，labeling index(LI) of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)of intestinal mucosa，and the expression of ras-p21 protein were significantly reduced in the tea-treated groups(P＜0.01) as compared with the positive control group.Furthermore，tea and tea pigments inhibited the expression of Bcl-2 protein and induced the expression of Bax protein(P＜0.05 or P＜0.01).The study provided evidence supporting that PCNA-LI，AgNORs，Bcl-2，Bax and ras-p21 protein could be used as effective biomarkers for colorectal carcinogenesis in human chemopreventive trials.

　　Keywords：biomarker，colorectal cancer，chemoprevention

　　生物学标志物是指在癌症发生和发展过程中检测到的与癌症发生有关的细胞和分子水平上的变化^［1］。生物学标志物的研究是癌症化学预防研究的热点。在癌症化学预防研究中，用生物学标志物作为观察终点可以减少样本量、缩短观察时间。我们在本次研究中通过观察茶对细胞增殖标志物、细胞凋亡标志物以及ras-p21的表达的影响，来评价茶对大鼠大肠癌化学预防作用效果。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　实验动物　雄性断乳Wistar大鼠(合格证号：医动字第01-3008号)由中国医学科学院动物中心提供，饲以动物中心提供的常备饲料。

　　1.1.2　主要试剂　绿茶(杭州炒青)、茶色素(纯度约40%，茶多酚的氧化产物)由中国农业科学院茶叶科学研究所提供；二甲基肼(DMH，Sigma公司)；鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、鼠型SP试剂盒、兔型SP试剂盒、DAB显色剂(ZYMED公司)；兔Bcl-2抗体、兔Bax抗体、Pan-ras抗体(Santa Cruz公司)；碱性磷酸酶标记二抗(VECTOR公司)；NBT/BCIP显色剂。

　　1.2　试验方法

　　1.2.1　动物分组与处理　112只大鼠，平均体重69.7g(59～81g)。在动物房温度为(24±1)℃和相对湿度为(50±10)%的条件下饲以常规标准大鼠饲料。适应1周后，随机分为4组：(1)阳性对照组；(2)绿茶水组；(3)茶色素组；(4)阴性对照组。

　　阳性对照组从实验第2周开始颈部皮下注射二甲基肼(DMH)20mg/kg BW，每周1次，连续10周。DMH配制方法：准确称取DMH，溶于1mmol/L EDTA中，用1mol/L NaOH调pH值至7.0。现用现配。

　　绿茶组和茶色素组处理同阳性对照组。并于注射DMH前2周分别给予2%绿茶水和0.1%茶色素溶液，直至实验结束。茶水及茶色素溶液均每天新鲜配制。绿茶水制备方法：将2g绿茶溶于100ml沸水中浸泡半小时，用纱布过滤饮用。茶色素溶液制备则按0.1%浓度直接溶于自来水。

　　阴性对照组颈部皮下注射相同剂量的EDTA。阳性对照组和阴性对照组在整个实验期间饮用自来水。

　　整个实验期间，每天观察动物一般情况，记录各组大鼠饮水或饮茶量。注射DMH期间每周称一次体重以调整DMH用量。以后每4周称一次体重。分别于实验第16和32周断头处死大鼠，取出大肠组织进行指标测定。

　　1.2.2　PCNA分析　PCNA测定用免疫组化SP法。同时用0.01mol/L PBS替代一抗作为阴性对照。PCNA阳性细胞细胞核被染成棕黄色，判定标准为每张切片在高倍光学显微镜下选有代表性的10个隐窝，记录每100个细胞中的PCNA阳性细胞数以表示其标记指数(LI)。

　　1.2.3　嗜银蛋白(AgNORs)分析　石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精水化，根据Ploton改良银染法配制胶体银染液^［2］：将明胶溶于1%的甲酸中，浓度为2%，再用50%的硝酸银按1∶2(V∶V)的比例混合。在室温下避光染色60分钟，终止染色后，梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片。每张切片在油镜下选有代表性的10个隐窝，每个隐窝计数20个细胞，测量每个细胞核的平均AgNORs颗粒数目。

　　1.2.4　Bcl-2和Bax蛋白分析　Bcl-2和Bax蛋白分析方法除了滴加的第一抗体为兔多抗Bcl-2和Bax抗体外同PCNA测定。Bcl-2和Bax阳性细胞细胞膜、细胞浆或核膜被染成棕黄色。判定标准为每张切片在光学显微镜下选有代表性的10个隐窝，根据隐窝中细胞的Bcl-2和Bax阳性细胞数占总细胞数的比例进行阳性分级：0%～25%为Ⅰ级；26%～50%为Ⅱ级；51%～75%为Ⅲ级；76%～100为Ⅳ级。

　　1.2.5　ras-p21蛋白表达检测　采用Western blot方法，以Pan-ras抗体(1∶500)和碱性磷酸酶标记的抗体(1∶500)分别作为一抗和二抗，BCIP/NBT显色剂显色，最后用IPP图象分析系统进行蛋白定量。

　　2　结果

　　2.1　大肠粘膜组织AgNORs颗粒数目

　　如表1所示，阳性对照组的每核AgNORs颗粒数目高于阴性对照组，且随着注射DMH的时间延长，AgNORs颗粒数目增多。饮绿茶和茶色素的动物，在注射DMH 16和32周后，AgNORs颗粒数均明显低于阳性对照组(P＜0.01)。

表1　饮茶对二甲基肼(DMH)诱发大鼠大肠粘膜组织

嗜银蛋白颗粒数目的影响(n=8，±s)

　　注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P＜0.012.2　大肠粘膜组织PCNA标记指数

　　如表2所示，阳性对照组PCNA标记指数显著高于阴性对照组。随着注射DMH时间的延长，PCNA标记指数增高。饮绿茶和茶色素组，在试验16和32周后，PCNA标记指数均显著低于阳性对照组(P＜0.01)。

　　2.3　大肠粘膜组织Bcl-2蛋白表达

　　如表3所示，Bcl-2在阴性对照组低表达，在阳性对照组，随着时间的延长，Bcl-2表达增高；两饮茶组在16和32周Bcl-2的表达均受到抑制，与阳性对照组比较差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

表2　饮茶对二甲基肼(DMH)诱发大鼠大肠粘膜组织

增殖细胞核抗原标记指数的影响(n=8，±s)

　　注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P＜0.01

表3　饮茶对二甲基肼(DMH)诱发大鼠大肠粘膜组织Bcl-2蛋白表达的影响(n=8)

　　注：与阳性对照组比较，经Wilcoxon检验，(1)P＜0.05 (2)P＜0.012.4　大肠粘膜组织Bax蛋白表达

　　如表4所示，Bax在阴性对照组低表达，在阳性对照组，随着时间的延长，Bax表达降低；两饮茶组在16和32周Bax蛋白的表达均得到诱导，与阳性对照组比较差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

表4　饮茶对二甲基肼(DMH)诱发大鼠大肠粘膜组织Bax蛋白表达的影响(n=8)

　　注：与阳性对照组比较，经Wilcoxon检验，(1)P＜0.05 (2)P＜0.012.5　大肠粘膜组织及肿瘤组织ras-p21蛋白表达

　　如表5所示，随着时间的延长，ras-p21蛋白表达增高；且肿瘤组织中ras-p21蛋白的表达比粘膜组织高。两饮茶组在16和32周时ras-p21蛋白的表达均得到抑制，与阳性对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。

表5　饮茶对二甲基肼(DMH)诱发大鼠大肠粘膜组织及肿瘤组织

ras-p21蛋白表达的影响(n=6，±s)

　　注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P＜0.013　讨论

　　PCNA又名周期素，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，分子量36kd，与DNA复制密切相关。PCNA是一种很稳定的蛋白，其抗原性经福尔马林或乙醇固定后仍保存完好。在福尔马林固定、石蜡包埋的大鼠大肠粘膜组织切片中，应用免疫组织化学方法检测到PCNA抗原的存在，方法简单易行。因此，PCNA可作为一个很好的生物学标志物来评价细胞的增殖活性。

　　AgNORs是另外一个比较好的细胞增殖标志物。NORs是细胞核内含rDNA的染色体片段，在RNA聚合酶Ⅰ作用下，rDNA转录生成rRNA，因此NORs是细胞内rRNA合成、核糖体颗粒组装、成熟转运的场所，参与蛋白质的合成。近年来发展起来的一步胶体银染技术可在常规组织切片上显示细胞核内的NORs，称为AgNORs，在显微镜下显示为黑色颗粒，计数为银颗粒^［3］。银颗粒由银与位于该区域的rRNA相关的酸性非组蛋白结合，该蛋白称为核仁组成区嗜银蛋白，参与rDNA的转录调节机制或维持rDNA链的伸展构型，因此，银颗粒数目可作为一种细胞增殖指标，反映细胞的增殖活性。

　　近年来，PCNA和AgNORs已作为生物学标志物被广泛应用于大肠癌化学预防研究。在本次研究中，饮用2%的绿茶水和0.1%的茶色素大鼠的PCNA标记指数(LI)和AgNORs颗粒数目在16和32周时均显著降低。

　　细胞凋亡不同于坏死，是一种特殊的主动死亡形式，细胞凋亡的触发是一个多基因表达的结果，bcl-2癌基因就是众多调控基因中研究最深入的一种。bcl-2癌基因的表达产物是分子量为25kd的Bcl-2蛋白，是一种膜结合蛋白，定位于线粒体膜、核膜及部分内质网膜上，发挥抗凋亡特性，因此又称为“抗凋亡蛋白”。

　　bax基因是bcl-2基因家族中的另一位成员，编码分子量为21kd的Bax蛋白。最近有研究表明，bcl-2基因家族的成员通常以二聚体的形式发挥作用，Bcl-2与Bax蛋白形成异二聚体，抑制细胞凋亡；Bax蛋白本身可形成同二聚体，促进细胞凋亡^［4］。本次研究结果发现与阳性对照组相比，饮茶抑制了Bcl-2蛋白的表达，诱导了Bax蛋白的表达。说明茶诱导了细胞凋亡。

　　大肠癌的发生还是一个多基因参与的多阶段过程。ras基因是其中出现最早、研究最深入的。ras基因编码21kd的膜结合蛋白ras-p21，定位于细胞膜的胞浆面，与鸟嘌呤核苷酸结合，执行信号传导功能。近年来的研究表明，ras-p21的高表达与细胞增殖有密切关系^［5］。Singh等在偶氮氧化甲烷(AOM)诱发的大鼠大肠癌模型中发现二氟甲基鸟氨酸(DFMO)和Sulindac均抑制了ras-p21的表达^［6］。结论认为ras-p21是一个有价值的生物学标志物，适用于大肠癌的化学预防研究。本次研究结果表明：DMH使ras-p21高表达，绿茶水和茶色素抑制了大肠粘膜及大肠肿瘤ras-p21表达。

　　总之，本次研究表明，我们所选用的这一系列生物学标志物(PCNA、AgNORs、Bcl-2、Bax以及ras-p21)应用于大肠癌的化学预防是可行的，也是有效的。

　　作者简介：贾旭东，男，硕士

　　参考文献：

　　［1］Benner SE，Hong WK，Lippman HS，et al.Biomarkers as intermediate points in chemoprevention trials.J Natl Cancer Ins，1990，82:55—57

　　［2］Ploton D，Manager M，Jeannesson P，et al.Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the nucliolar organizer region at the optical level.Histochem J，1986，18:5—14

　　［3］Howell WM，Black DA.Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer:1-step method.Experientia，1980，36:1014—1015

　　［4］Reed JC，Tsujimoto Y，Alpers JD，et al.Regulations of bcl-2 proto-oncogene expression during normal human lymphocyte proliferation.Science，1987，236:1295

　　［5］Singh J，Reddy BS.Molecular markers in chemoprevention of colon cancer:inhibition of expression of ras-p21 and p53 by sulindac during azoxymethane induced colon carcinogenesis.Ann N Y Acad Sci，1995，768:205—209

　　［6］Singh J，Kelloff G，Reddy BS.Intermediate biomarkers of colon cancer:modulation of expression of ras oncogene by chemopreventive agents during azoxymethane induced colon carcinogenesis.Carcinogenesis，1993，14:699—704

收稿日期：1999-09-17