大肠癌基因改变的研究

世界华人消化杂志 1998年第1期第6卷 编委论坛

作者：许昌泰¹ 潘伯荣²

单位：1解放军473医院消化血液科 甘肃省兰州市 730070;2第四军医大学621栋12室 陕西省西安市 710033

关键词：癌基因；结肠肿瘤/遗传学；直肠肿瘤/遗传学；基因，抑制，肿瘤

Gene changes in colonic cancer

　　xU CT, Pan BR

　　中国图书资料分类号 R 735.34

　　1 癌症基因改变

　　1.1 癌基因与抗癌基因^［1-4］ 癌基因(oncogene)是指细胞内或病毒内存在的，能诱导正常细胞发生转化，使正常细胞获得一个或更多的新生物特性的基因.通常人们又根据癌基因的来源，特性等将其分为病毒癌基因，细胞癌基因及原癌基因.病毒癌基因是指病毒所携带的，或病毒所含有的能使细胞转化的基因.细胞癌基因是指在正常细胞内存在的，与逆转录病毒癌基因具有同源序列，通常参与细胞生长，代谢的基因. 而原癌基因是指正常细胞基因在一定条件下可被激活，参与细胞转化及肿瘤发生过程的基因。病毒癌基因又分为RNA病毒癌基因及DNA病毒癌基因. 而细胞癌基因和原癌基因与

　　rNA病毒基因密切相关^［3,5］. 抗癌基因(anti-oncogene)或癌阻遏基因(suppress

　　oncogene)是指正常细胞存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的基因.它们的丢失或失 活与肿瘤的发生密切相关.

　　正常细胞，除了血细胞及免疫细胞以外，在培养体系中呈贴壁式生长。

　　当贴壁生长至单层细胞时细胞停止分裂的状态叫做密度依赖的生长抑制，或接角抑制. 在癌基因作用下，失去生长抑制的细胞被称为转化细胞(transformed

　　cell). 转化细胞具有如下特点^［2,5］：①不象正常细胞需要贴壁式生长，它们可悬浮式生长；②在较低浓度的血清培养基中可以生长良好；③它们失去生长抑制，可以在软琼脂上呈克隆化生长；④经常表现出细胞染色体异常及超过正常双倍体的数目；⑤对某些细胞毒剂呈抵抗状态；⑥获得不死性；失去衰老特征，能在细胞培养体系中不断地传代增殖；⑦转化细胞多数都能在接种实验中成瘤，具有在活体内形成实体瘤的能力。

　　1.2 癌基因的激活 许多实验证明，原癌基因在生理状态下，参与细胞正常的生长，代谢过程，是细胞增殖，分化不可缺少的一部分.只是在特定的环境下，原癌基因的数量，质量才发生变化，以致功能异常，使细胞增殖，分化过程失去平衡，导致肿瘤发生.从原癌基因转化成癌基因过程被称为原癌基因的激活. 癌基因的激活主要包括以下几方面：①基因突变^［2，5］：一个或几个核苷酸序列改变称为点突变. 更多的核苷酸序列的改变称为突变.细胞癌基因与原癌基因在没有病毒基因感染下之所以能起到病毒癌基因所起的作用，其重要原因之一是因为基因突变. 目前最常见的是ras基因的突变.无论是在理化因素诱导的动物肿瘤中，还是在人类自然发生的肿瘤中都发现ras基因突变.突变的位置最常见是第12位与第61位上的脯氨酸被其他氨基酸所取代，致使其基因产物

　　p21蛋白功能改变，使细胞转化. 另外，突变也包括插入突变. 许多实验证明，逆转录病毒癌基因无论是结构基因的插入还是调控序列的插入，突变均可导致细胞癌基因的激活. 常见的细胞癌基因激活的突变是插入突变.②基因易位^［6］：染色体是基因高度密集，有序排列的场所.染色体重排，能引起所携带的基因转位，错位.由于基因排列与基因的表达，调控，以至与蛋白产物密切相关，因此基因转位能使基因表达，调控改变，进而激活. ③基因扩增^［2，6］：基因扩增是指细胞内某一基因的拷贝数高于正常。正常情况下，基因扩增的几率为万分之一.但在肿瘤细胞中，某些原癌基因拷贝数大大超过正常却很常见，引起基因表达及产物在数量上的异常.有人推测它是由于在致癌因素作用下，细胞出现了分裂周期不相应DNA合成所致。

　　1.3 肿瘤癌变的“两次打击(two-hit)学说” “两次打击”学说的最早提出是在1971年，Knudson通过对儿童视网膜母细胞瘤发病率的分析，认为此病的发生是两次突变的结果.家族型者第一次突变发生于生殖细胞，第二次突变发生于出生后体细胞，大量分子生物学研究已证实了这种由统计学分析提出的“两次打击”学说。“两次打击”的实质是视网膜母细胞敏感基因(Rb1)的一对等位基因均发生突变. 在遗传性病例中，由于生殖细胞已有一个Rb基因失活，出生后再需一个体细胞性Rb基因失活即可形成肿瘤，因此发病较早；而在散发性病例，需经两次体细胞性Rb基因失活才能形成肿瘤，因此发病较晚.肿瘤的遗传易感性可能即与某些遗传性疾病或缺陷伴有一个抗癌基因的失活有关^［7-9］.

　　纯合子型Rb基因失活(即Rb基因的一对等位基因均失活)，不仅发生于视网膜，也可见于这种患者的其他组织，而且也是两个Rb等位基因的同时失活，表明正常的

　　rb基因在不同的组织中均有抗癌作用. 目前已在许多常见的人类恶性肿瘤组织中发现Rb基因的失活. 最近有人在Li-Fraumani综合征患者中发现p53基因也存在种系突变，提示p53基因可能也受遗传倾向的影响，因此，“两次打击”学说可能具有一定的指导意义。“两次打击”学说主要适用于有遗传倾向的肿瘤，如视网膜母细胞瘤，Wilms瘤，软骨肉瘤，神经母细胞瘤等，而对于大多数成人散发性肿瘤，则更多的倾向于认为是多个遗传学改变积累的结果。结直肠癌模型则更能解释结直肠腺癌发生以及其他一些腺癌的发生^［1，10］。

　　2 大肠癌常见基因改变

　　已有研究表明，大肠癌的发生与多个癌基因有关，这些癌基因包括ras,myc,mcc,

　　src和erb，以及抑癌基因p53等,但大肠癌主要是ras，myc和mcc癌基因的改变，而一般认为ras基因的突变激活和抑癌基因即p53基因的失活(包括突变和丢失)是原发性肿瘤和化学诱导的肿瘤组织中最常见的两种基因改变。

　　2.1 ras基因改变^{［10，11］} ras基因转录的是一种Mr21 000的蛋白质(P21 ras)。

　　该蛋白质位于细胞膜内侧，可以结合鸟嘌呤核苷酸并具有GTP酶活性，参与通过细胞的信使传递过程. ras基因家族成员(H-, N-, K-ras)的改变是人类肿瘤中最常见的一种基因异常，目前已在许多常见的人类恶性肿瘤组织中发现ras基因的突变激活.其突变发生率在不同的肿瘤类型中变化很大，胰腺癌高达90%，结肠癌和甲状腺肿瘤约

　　50%，肺癌和髓性白血病也约30%，而在食管癌和胃癌则很难发现ras基因的突变激活，肿瘤类型不同，ras的突变也各异.一般来说，一种类型的肿瘤多以一种ras的突变激活为主， 但也有含一种以上ras突变者，甚至一种肿瘤的不同组织类型，其ras突变的类型也各不相同.以腺癌为主要组织类型的肿瘤如肺癌，胰腺癌，结肠癌等多以

　　k-ras突变为主，而N-ras突变主要见于髓性白血病，它可以同时发现H-,K-,N-ras三种ras基因的突变激活，目前用于检测ras基因突变方法主要有：3T3细胞转染，限制性片段长度多态性分析，特定寡聚核苷酸探针杂交，RNA酶错配裂解(RNase mismatch

　　cleavage)，直接测序，聚合酶链反应(PCR)及上述几种方法的结合等.

　　人们在大量的研究中发现，ras基因的突变通常以某种特定的形式(点突变)发生特定位点(12，13或61密码子). 结肠癌中，大多数突变为K-ras基因的第12密码子的第二个碱基发生G→A置换，而这种类型的突变是烷基化试剂的特征，因此人们有理由相信，结肠癌中这种特定位点的ras突变可能与这些烷基化试剂的作用有关。

　　而在肺腺癌中K－ras的突变多为第12密码子的第二碱基发生G→T置换，这种突变类型的不同可能表明涉及不同的致癌物，至于何种致癌物目前尚不清楚，但人们发现在肺腺癌中ras的突变与患者的吸烟史之间存在某种相关，提示烟草中某种致癌物可能与这种ras突变有关.上述发现促使人们更多地研究特定化学致癌物及其诱导的恶性肿瘤中特定ras位点的突变及这种突变与细胞癌变过程的关系，目前这方面已有不少报道.

　　房殿春 et al^［12］用PCR并配合限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术对4例外科手术切除的大肠癌标本APC，MCC和DCC基因LOH进行检测，结果表明APC和MCC基因缺失可能发生于大肠癌的早期，而DCC基因LOH常见于晚期大肠癌，可能与大肠癌的进展和转移有关. 成继民 et al^［13］应用CEA，rasP21和PCNA，通过ABC法对25例大肠腺瘤癌变组织进行了检测. 结果显示CEA和P21在癌变组织中表达类似，但后者更敏感，对乳头型腺癌变组织表达更强. PCNA在癌变组织中阳性表达很敏感。在管状型和乳头型腺瘤癌变组织中表达类似。并与癌变组织的异型性成正相关。

　　大肠腺癌中50%有ras基因突变，88%为Ki-ras突变，少部分为N-ras突变. h-ras基因编码的P21蛋白可将表皮生长因子和胰岛素的刺激信号传入相应的靶细胞内，将外环境得到的信号传至细胞核，因而ras癌基因的作用可能为控制细胞增殖.研究已证实，突变的ras基因表达与肿瘤进展有关. 而关于ras基因家族点突变在肿瘤进程中哪个阶段起作用仍不清楚。P21是ras癌基因家族的一种共同蛋白质表达物，正常情况下可调节细胞生长发育，而在异常情况下可使细胞分化，增殖失控发生癌变.通过对组织中P21的检测，可以了解ras癌基因在蛋白质水平的表达，并借此了解ras基因激活，扩增等情况。

　　2.2 myc癌基因 基因家族有6个成员，c-myc是与大肠癌相关的基因之一，它的异常主要是表达水平的失调表现为过度表达，从而使大肠癌细胞处于不断的增殖状态. 60%～80%的大肠腺癌中c-cym mRNA比正常大肠粘膜高40～50倍，但无基因扩增和重组现象，无点突变，其机制尚不清楚，可能系5q等位基因缺失有关。

　　c-myc基因扩增多见于恶性程度较高的大肠癌。

　　c-myc基因具有协同ras基因的作用，即ras基因产物的活化和致癌必须有其他细胞核癌基因的协同作用，其中最重要的是c-myc基因^［6，11］.该基因定位于染色体8q24，约4kB，产生两组分子分别为Mr 62 000～64 000和Mr 66 000～67 000的蛋白质，在细胞核内结合于单链或双链DNA上，对转录过程实施调控. c－mgc表达活性与细胞生长分裂速度密切相关。

　　2.3 其他基因改变^{［10，11］} DCC基因，它存在于大多数正常组织，是一个370kB的大分子，其产物为一组Mr 190 000的糖蛋白，位于细胞膜上. DCC基因产物可能通过参与细胞间的表面相互作用，引起细胞粘附改变而影响癌的发生发展. fAP基因，它是染色体5q21-22的一个等位基因，编码含2843个氨基酸的蛋白质，这种蛋白质具有GTP酶样活性. FAP基因最早发现于常染色体显性遗传的家族性腺瘤样息肉病(familial

　　adenomatous polyps, FAP). MCC基因位于细胞膜下，其产物含829个氨基酸，分子量为

　　mr 190 000的G蛋白，目前已发现在大肠癌中，MCC基因存在的DNA重排和点突变现象，可能是5q21上的大肠癌抑制基因的靶基因.此外在肿瘤中还常见多等位基因丢失现象，以及肿瘤转移阻遏基因(tumormetastasis suppresion gene)和c-erbB-2基因改变等.

　　2.4 p53基因改变 Chilosi et al^［15］应用免疫组织化学S-P法检测了76例大肠癌及其癌旁移行粘膜的P53蛋白表达情况，结果提示p53表达可反映肿瘤的进展与转移情况，并可能表示预后差。

　　p53基因因其编码产物为Mr 53 000的核磷蛋白而得名. p53基因改变也是人类肿瘤最常见的一种基因的改变，目前已在几乎所有系统人类恶性肿瘤中发现有p53基因的改变，主要表现为突变和缺失. Nigro等(1990)认为大多数肿瘤中往往是两种形式并存，即一个等位基因点突变而失活，另一条等位基因则表现为17p(p53存在位点)的杂合性丢失. 序列分析表明，p53基因突变的热点位于5～8外显子中的四个高保守序列式，分别在第132～143，174～179，236～248和272～281密码子之间，而这些序列区可能是P53蛋白生物学活性的关键部位. 野生型P53蛋白类似于Rb蛋白，其功能是由其与基因组中特异性DNA序列结合的能力而介导的. 突变的P53蛋白失去了与这段特异性DNA序列结合的能力，因而表现为正常的“肿瘤抑制”功能丧失.突变的P53蛋白还能通过与野生型P53蛋白的结合而对后者起显性抑制效应(dominant negative effect)，从而使细胞处于不受控制的生长状态. P53蛋白也可由于和SV40大T抗原及腺病毒E1B的Mr

　　55 000肿瘤抗原形成复合物而失活，最近发现人乳头状瘤病毒16型(HPV16)的转化蛋白

　　e6亦能与P53蛋白结合而使其失活. p53基因改变在癌变过程中可以单独作用，亦可见于其他癌形成的早期，但更多的是发生于肿瘤形成的相对晚期. Baker等(1991)认为

　　p53基因的点突变可能是p53等位基因功能的“限速点”，即一旦同源染色体中的一条发生p53基因的点突变，另一条正常的p53等位基因也常发生缺失^［5,6,14］.因此，大肠癌的发生也存在p53基因的失活。

　　2.5 PCNA(增殖细胞核抗体) PCNA是一种Mr 36 000的核蛋白，它的出现与细胞周期中的G1期和DNA合成期(S期)有着密切联系，表示细胞正处于活跃的增殖状态，在大肠癌变的表达也很敏感. 应用抗PCNA单克隆抗体，可显示正处于增殖状态的细胞核，故可用来鉴别癌细胞与正常细胞，并以此判断大肠癌的预后^［13］. sun et al^［16］对大肠癌PCNA等的研究后表明，PCNA过度表达与ras,c-erbB-2,p53，临床病理改变和预后密切相关。Kovac et al^［17］分析114份大肠癌活检标本的PCNA表达情况，并对患者进行追踪随访，结果表明PCNA可以作为结肠癌预后的一项独立指标。

　　大肠癌是一种基因病，正常细胞在生长，分化过程中癌基因的激活或获得，抗癌基因的失活或丢失均可使肠道正常细胞转化为肿瘤细胞. ras基因突变激活和p53基因的抑制失活是大肠癌常见的基因改变，而PCNA则是大肠癌预后的敏感指标之一。

　　通讯作者 许昌泰

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　　收稿日期 1997-05-06