双歧杆菌对人大肠癌HT₂₉细胞谷胱甘肽巯基转移酶基因的诱导表达

　　中国微生态学杂志2000年第12卷第1期

唐立　赵宝昌　崔秀云

　　 摘　要：应用北杂交技术研究双歧杆菌对大肠癌HT₂₉细胞谷胱甘肽巯基转移酶基因的诱导表达发现：双歧杆菌及其发酵过滤液在作用HT₂₉细胞2小时后，谷胱甘肽巯基转移酶基因的mRNA分别提高1.4倍和1.3倍，提示诱导谷胱甘肽巯基 转移酶基因的高效表达，阻断外来致癌物的亲核攻击可能是双歧杆菌抗肿瘤的一个分子机制。

　　 关键词：双歧杆菌　谷胱甘肽巯基转移酶　基因

　　谷胱甘肽巯基转移酶(Ec2.5.1.18，GSTs)是一类催化谷胱甘肽巯基免受 外来化合物攻击的酶^［1，2］，又称Ⅱ相酶。GSTs广泛分布于动物、植物、昆虫、 真菌、细菌细胞中。引人注目的是在肿瘤基因表达过程中GSTs的高效表达活化能抑制C-fos/ Jun RNA转录^［3，4］。研究表明双歧杆菌具有抗肿瘤活性，其机制不清，现有的 抗肿瘤药物中许多具有调控GSTs的高效表达活性，因此了解双歧杆菌调控大肠癌细胞GSTs基 因表达对解释双歧杆菌抗肿瘤分子机制具有十分重要意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　

　　1.1.1　GSTs质粒　Vector4149bp,GSTs690bp Ap^rECoRI、ClaI二个切点 ，大连医科大学催秀云教授惠赠。

　　1.1.2　主要试剂　ECoRI、ClaI购自大连宝生物公司，异硫氰酸胍、十二 烷基肌氨酸钠，DEPC购自Sigma公司，DIG随机引物杂交试剂盒购自Roche Digagnostics公司 (德国)，氯仿、异丙醇、无水乙醇、酚、甲醛、马来酸均国产分析纯。

　　1.1.3　细胞株　HT₂₉(ATCC)中国医科大学宋金丹教授惠赠。

　　1.1.4　长双歧杆菌　本室分离，经中国科学院微生物所鉴定。

　　1.2　方法

　　1.2.1　双歧杆菌按常规培养，取对数期双歧杆菌体3×10⁹/ml 1ml及对数期双歧 杆菌培养过滤液1ml，分别作用10⁷个HT₂₇细胞2h，低速度离心，收获细胞，用无血 清RPMI-1640洗三次，提取细胞总RNA。

　　1.2.2　GSTs质粒制备、酶切及探针标记、GSTs mRNA制备、转膜按《分子克隆指南 》方法进行^［5］。

　　1.2.3　DNS-RNA杂交及检测按试剂盒提供方法进行。

　　2　结　果

　　2.1　GSTs质粒酶切电泳，由图1所见GSTs质粒经EcoRI，ClaI酶切二片断，500bp～7 50bp间为GSTs基因片段。

图1　EcoRI,CalI切割质粒DNA的电泳分析(1)GSTs片断　　(2)GSTs质粒

　　2.2　HT₂₉细胞总RNA提取转膜电泳分析，由图2所见HT₂₉细胞经双歧杆菌发酵 过滤液作用2h后，总RNA转膜电泳结果。

图2　双歧杆菌诱导HT₂₉细胞mRNA转膜电 泳分析

(1)对照　　(2)发酵滤液　　(3)双歧杆菌

　　2.3　GSTs mRNA的Northern杂交，由图3可见经双歧杆菌与双歧杆菌发酵过滤液作用的HT 29细胞DNA-mRNA量高于对照。

图3　HT₂₉细胞GSTs mRNA北杂交结果(1)对照　(2)双歧杆菌诱导　(3)发酵滤液诱导

　　2.4　GSTs mRNA Northern杂交的计算机扫描分析，由图4所见双歧杆菌作用HT₂₉细 胞GSTs mRNA表达量提高1.4倍，双歧杆菌发酵过滤液可提高表达量的1.3倍。

图4　HT₂₉细胞GSTs mRNA北杂交尼龙膜的计算 机扫描结果

　　3　讨　论

　　本实验应用Northern杂交方法观察到双歧杆菌可诱导HT₂₉细胞GSTs mRNA表达，二种 处理都使HT₂₉细胞GSTs mRNA表达量提高，这表明双歧杆菌可调控肿瘤细胞的基因表 达。GSTs基因定位于人类第六号染色体上，主要分布于人的肝脏、肾脏、大肠小肠细胞中， 外来 化合物如药物、食品添加剂、致癌化合物等被人体摄入后，在胃肠道细胞内首先经Ⅰ相酶P ₁-450作用被氧化还原生成异生物(Xenbiotics)，大部分Xenbiotics被进一步水解排出细 胞外，而有一些Xenbiotics和醌类化合物经P₁-450酶作用后产生强极性，对组成基因的大 分子发生亲核攻击导致 基因突变，影响基因表达，而Ⅱ相酶如GSTs可与巯基结合的极性化合物结合降低其与巯基结 合的活性，从而排出Xenbiotics保护细胞正常代谢，影响癌细胞的发生^［6］。双歧杆菌可影响致癌物的代谢，同时又能诱导肠细胞内消除致癌物的酶基因表达可能是其抗肿瘤的一个分子机制。

　　基金项目：3940049　国家自然科学基金项目作者简介：唐立(1962～)，男，副所长，副教授，理学博士，主攻人类肠道菌群与其宿主相互作

　　用关系的细胞分子机制。

　　作者单位：唐　立　大连医科大学微生态研究所，大连　116027

　　赵宝昌　大连医科大学微生态研究所，大连　116027

　　崔秀云　大连医科大学生化教研室

　　参考文献

　　［1］Mannervik B and Panielson V H.Glutathlone S-transferases-structure and catalytic activity.CRC Crit Rev Biochem,1988,23:283.

　　［2］Mannervik B.The isoezymes of glutathione transferase.Adv Enzymol,19 85,57:357.

　　［3］Pinkus R,et al.Phenobarbital induction of AP-l binding activity medi ates activity of glutathione S-transferase and quinone reductase gene expression.Biochem J,1993,290:637.

　　［4］Daniet V,et al.The role of AP-l transcription factor in the regulation of glutathione S-transferase Ya subunit gene expression by chemical agents,in structure and function of glutathione S-transferase.CRC Press.Boca Raton FL,1993.

　　［5］J.萨姆布鲁克，EF.费里奇，T.曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南.科学出版社.第二版.1996.

　　［6］gerald D,Fasman.Glutathione S-Transferase gene structure and regulation of Expression.Critical Revuews in Biochemistry and Molecular Biology,1993,28(3):173～207.