逆转录病毒载体介导的IL-6大肠癌基因治疗实验研究
癌症 1999年第3期第18卷 基础研究
作者：肖冰 周殿元 张万岱 姜泊 张亚历
单位：肖冰（第四军医大学西京医院消化内科 西安，710032）；周殿元 张万岱 姜泊 张亚历（第一军医大学南方医院消化内科 广州，510515）
关键词：大肠肿瘤；IL-6；逆转录病毒；基因治疗；
【摘要】目的：探讨IL－6转基因表达对大肠癌细胞的体内外抑制作用。方法：参照分子克隆技术将重组逆转录病毒载体pZIPIL－6cDNA转染PA317包装细胞，以G418筛选抗药性细胞，常规制备重组病毒液并感染大肠癌HT－29细胞，采用NorthernBlot分析基因转录水平，ELISA法和MTT显色法检测蛋白表达的量与细胞活性，以细胞生长曲线和集落形成实验以及裸鼠移植瘤实验，观察转导株的体内外抑瘤作用。结果：制备了高滴度的重组病毒液(5.1×105cfu/ml)，建立了稳定表达IL-6的转导细胞(HT－29/IL－6)，表达的量与活性分别为1132.5pg/ml与150U/ml，转导株的细胞群体倍增时间为2.5天，对数生长期在4～7天之间，集落形成率和抑制率分别为2.21％和50％，接种裸鼠皮下的出瘤时间为13.5天，最终瘤体直径在6.5～8.5mm之间，以上参数与非转导株HT-29细胞相比，均有显著差异。结论：通过逆转录病毒载体的介导，IL-6基因能稳定整合在靶细胞染色体，并进行有效的转录表达，IL-6转基因表达可明显抑制大肠癌细胞的体外增殖和体内移植瘤的形成与发展。
中图号：R33434文献标记码：A文章编号：1000－467X(1999)03－0250－03
Retroviral vector mediated IL-6 gene therapy for
human colon cancer cells.
XIAO Bing， ZHOU Diang-yuan，ZHANG Wan-dai，et al.
Department of Digestive Diseases,Xijing hospital,Xian 710032,China
【Abstract】Objective：To investigate the regulatory effect of IL－6 exression on colon cancer cells.Methods：Human IL－6 gene was successfuly reconstructed into retroviral vector pZIPIL－6cDNA and transfected into package cells PA317,which were then selected by antibiotic G418.Human colon cancer cells HT－29 were infected with the prepared recombinant virus granules.IL－6 gene were analyzed with Northern Blot at transcription level and the expression of protein were measured with ELISA and MTT method.Furthermore,the tumor repression function of the transfected cells were observed in vivo and in vitro through cells growth curve,plating efficiency and the inoculated tumors in nude mice.Results：High titer recombinant virus granules were prepared and stably expressive transfected cells HT－29IL－6 were constructed,the amount of the secreted protein was 1132.5 pg/ml and the activity was 150U/ml.Doubling time of the transfected cells was 2.5 days and log phase of growth was 4～7 days,plating efficiency and repression rate were 2.21％ and 50％ respectively.The tumor forming time in the inoculated nude mice was 13.5days and the final diameters of the tumor were among 6.5 to 8.5 mm,signifiantly lower than the nontransfected cells.Conclusion：Mediated by retroviral vector,IL－6 gene can be stably expressed in the human colon cancer cells,and the expression clearly repress the proliferation of colon cancer cells in vitro and growth of the inocculated tumor in vivo.
Key words：Colon neoplasms;IL－6;Retrovirus;Gene therapy
大肠癌是消化道常见恶性肿瘤，为威胁人类健康的十大恶性肿瘤之一，而目前常见的临床治疗手段仍不尽如人意，因此，利用现代分子克隆技术进行新领域的探讨与尝试将有利于大肠癌治疗的研究。IL－6为多功能细胞因子，其中抗癌活性是近年来研究并被证实的功能之一〔1〕。为使靶细胞能持续而大量分泌IL－6，将IL－6基因导入靶细胞，是肿瘤基因治疗的重要方式之一。
1 材料与方法
1.1 细胞与质粒
pA317、NIH3T3、HT－29等细胞株为本所保存细胞，pUCIL－6cDNA和pZIPcDNA质粒为军事医学科学院张宏权教授惠赠。
1.2 试剂
BamHⅠ、EcoRⅠ内切酶及Klenow大片段酶，T4DNA连接酶，G418，DEPC，MTT等购于华美生物公司，〔α－32p〕dATP源于北京亚辉公司。
1.3 动物
BALB/Cnu/nu雌性裸鼠20只，3～4周龄，由上海肿瘤研究所引进。
1.4 重组病毒的制备与鉴定
按照分子克隆的方法构建重组逆转录病毒载体pZIPIL－6cDNA，以脂质体介导法将重组载体转导PA317包装细胞，G418筛选抗药性细胞，常规制备重组病毒液并感染NIH3T3细胞，筛选克隆及计算病毒滴度(克隆数×病毒液稀释倍数)。
1.5 基因转导株的建立与鉴定
重组病毒液感染大肠癌HT－29细胞，抗药性筛选后收集细胞提取总RNA及进行同位素标记的NorthernBlot分析。ELISA法和MTT显色法检测转导细胞表达IL－6的量与活性。
1.6 基因转导细胞的体外生物学活性检测
参照细胞直接计数法检测基因转导前后HT－29细胞在10天内的生长规律与增长速度。采用MTT显色法观察细胞在96孔板中分别培养48，72，96，120小时的增殖水平。根据细胞集落形成实验方法，在24孔板中制备0．3％和0．5％的上、下层软琼脂(含20％小牛血清)，在不同孔中分别加入转染前后的细胞(2×103cells/孔)，培养3～4周，观察集落形成率。
1.7 裸鼠体内抑瘤试验
将20只裸鼠分成4组，每组5只。第1、2两组均接种HT－29细胞，后两组分别接种空病毒载体和重组载体转导的大肠癌细胞。每只裸鼠接种5×106细胞至左腋皮下。当第2组出瘤后(即瘤径达3mm时)向瘤内注射重组病毒液(称为治疗组)。饲养40天，观察出瘤时间、出瘤率、瘤径大小、裸鼠生长状态及移植瘤标本的病理特点并与对照组比较。
2 结果
2.1 抗药性细胞的形成与重组病毒液测定
基因转染后筛选3～4周开始出现抗药性细胞，并逐渐形成克隆。收集转染细胞上清制备的重组病毒液感染3T3细胞和筛选2～3周，出现大量克隆细胞，计算其滴度为5.1×105cfu/ml。
2.2 转导株的建立及表达
高滴度的重组病毒液感染大肠癌HT-29细胞并筛选2～3周，80％细胞存活，此即为基因转导细胞HT-29/IL-6。同位素杂交结果显示该细胞具有IL-6mRNA高效表达。检测表明其表达IL-6的量为每24h132.5pg/ml(106cells)，其活性各150U/ml，而非转导细胞表达量在50pg/ml以下。
2.3 IL-6的体外抑瘤效应
基因转染前后HT－29细胞的生长曲线见图1所示，非转导细胞和空病毒转导细胞HT－29pZIP的群体倍增时间分别为1.5天和1.6天，对数生长期分别在2～7天和3～8天之间。HT－29/IL－6细胞群体倍增时间为2.5天，对数生长期在4～7天之间，最大细胞数为2.5×105，明显低于非转导细胞。MTT显色法结果见图2，转导株的增殖曲线与另二组相比，显得平稳而上升缓慢。接种于软琼脂的各株细胞从第12～14天始逐渐有细胞集落形成，3～4周后集落数不再增多。各组细胞集落形成率如表1所示，统计表明转导株集落抑制率达50％。
 图1 IL-6表达细胞体外生长曲线 |
 图2 MTT显色法细胞体外增殖曲线 |
|
表1 IL－6对HT－29细胞软琼脂集落形成能力的影响 |
| 细胞 |
鼠数 |
克隆数 |
 ±s |
形成率(％) |
P值 |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
| HT－29 |
5 |
86.0 |
89.0 |
92.0 |
80.0 |
97.0 |
88.8±8.5 |
4.21 |
＜0.05 |
| HT－29/IL－6 |
5 |
42.2 |
52.0 |
41.0 |
39.0 |
47.0 |
44.2±4.5 |
2.21 |
2.4 IL－6的体内抑瘤效应
细胞接种后第8～14天局部陆续长出细小的肿瘤并不断增大，其中不同实验组的出瘤时间和最终瘤径大小以及瘤体体积见表2。转染株平均出瘤时间比非转导细胞延后了5.5天，并有一只转导株未能出瘤，肿瘤增长速度明显缓慢，瘤体体积明显较小，裸鼠活动状态良好。尤其是重组病毒液治疗组，其瘤径最小。
表2 裸鼠移植瘤生长结果
| 组别 |
接种鼠数 |
出瘤数 |
出瘤时间
(days) |
瘤径(mm) ±s |
瘤体体积(mm3)s
V±a |
抑制率(％) |
| HT-29 |
5 |
5 |
8 |
20.8±3.2 |
4750.3±60.4 |
－ |
| HT-29/pZIP |
5 |
5 |
8.5 |
18.2±3.9 |
3160.9±57.2 |
33.5 |
| HT-29/IL-6 |
5 |
4 |
13.5 |
8.5±2.8※ |
331.7±26.1※ |
93 |
| 治疗组 |
5 |
5 |
8 |
6.5±2.1※ |
141.8±21.5※ |
97 |
3 讨论 IL-6基因转导肿瘤细胞的研究最早见于Porgador〔2〕等人将IL-6基因转染低免疫原性、高转移性的D122Lewis肺癌细胞后，该转染株在体外生长受到明显抑制，且细胞表面的MHC抗原密度比野生型D122高2.5～4.5倍，经体外灭活的转染株免疫后，同基因小鼠体内的CTL活性及巨噬细胞活性均明显提高，并能阻止随后接种的野生型D122细胞在体内生长及转移。同年Sun等人将IL-6基因转染小鼠B16黑色素瘤也发现该转染株的恶性程度下降。根据我们实验的结果，说明通过逆转录病毒载体的介导，外源性IL-6基因转导大肠癌HT-29细胞后，由于载体携带了有效的启动子、增强子等调控元件，使IL-6mRNA的转录表达显著提高，且分泌目的蛋白的量与活性均达到了产生效应的要求。因而该转染株在体外的生长增殖和在体内的肿瘤形成能力均明显受到抑制，其中以重组病毒液瘤内注射的效果尤为显著，提示体内转导可能优于体外转导。至于IL-6的抗瘤机制目前研究不多，一般认为除IL-6直接作用于肿瘤细胞外，主要是通过免疫效应。人肿瘤相关抗原和主要组织相容性抗原的表达水平对机体免疫系统识别肿瘤细胞具有重要意义，调节这些抗原在靶细胞表面的表达水平将改善体液和/或细胞免疫的治疗效应。Ullmann[3]等发现IL-6能增加人大肠癌细胞表面CEA和HLA-1类抗原的表达水平，并与剂量和作用时间呈正相关。Tsang[4]和Dansky[5]等证实HT-29/IL-6细胞CEA表达水平明显高于未转染基因的HT-29细胞和转染非相关基因的HT-29细胞。IL-6在调节体液免疫反应方面，可增强体内抗原特性的初次和二次抗体应答，由特异性抗体细胞介导ADCC效应，或经抗体依赖性补体介导的溶细胞作用，辅助抗肿瘤免疫。IL-6可通过继发性释放或激活与调节其它细胞因子以增强机体免疫功能〔6，7〕。IL-6诱导和激活抗癌效应细胞的活性与作用是IL-6与肿瘤免疫的另一重要体现。Van〔8〕等研究表明IL-6可增强人LAK细胞的诱导，提高其杀瘤活性，此效应可被IL-6抗体阻断。NK细胞产生包括IL-6在内的多种细胞因子，而IL-6则是调节NK细胞活性的重要因子，提高其功能发育与分化过程，显著增强其杀伤活性。IL-6尚能增强和诱导体内CTL产生，直接增强体内特异性抗肿瘤免疫。总之，转导外源性IL-6基因后由于自分泌和旁分泌的效应。在机体免疫网络中发挥广泛的生物学效应〔9〕，通过多种途径直接和间接地产生抑瘤或杀瘤活性。
基金项目：全军八五重点攻关课题资助项目，No.91A022－0056
参考文献
1 Liu Z S,Impson RJ.Cheers C.Recombinant interleukin－6 protect mice against experimental bacterial infection〔J〕.Infect lmmunity,1992,60：4402.
2 Porgador A,Txehoral E,Katz A,et al.Interleukin－6 gene transfection into lewis lung carcinoma tumor cells suppresscs the malignant phenotype and confers immuno－therapeutic competence against parential metastatic cells〔J〕.Cancer Res,1992,52：3677.
3 Ullmsnn CD,Schlom J,Greiner JW.Interleukin－6 increase carcinoma cmbryonic antigen and histocompatibility lukocyte antigen expression on the surface of human colorectal carcinoma cells〔J〕.Immunol,1992;12：231.
4 Tsang K Y,Kashmiri SV,QI CF,et al.Transfer of the IL－6 gene into a huma colorectal carcinoma cell line and condequent of tumor antigen expression〔J〕.Immunol Letters,1993,36：179.
5 Dansky UC,Salgaller M,Adams S,et al.Synergistic effects of IL－6 and IFN－gamma on carcino embryonic antigen (CEA) and HLA expression by human colorectal carcinoma cells：role for endogenous IFN－bcta〔J〕.Cytokine,1995,7(2)：118.
6 Inouet T,Saito H,Fukushima R,et al.Growth hormone and insulin－like growth factorⅠenhance host defense in a murine sepsis model〔J〕.Arch Surg,1995,130(10)：1115.
7 Revel M,Katz A,Eisenbach L,et al.Interleukin－6： effects on tumor models in mice and on the cellular regulation of transcription factor IRF－1〔J〕.Ann N Y Acad Sci,1995,762：342.
8 Van Snick J.Interleukin－6：an overview〔J〕.Ann Rev Immunol,1990,8：253.
9 Freeman SM,Ramesh R.Shastri M,et al.The rle of cytokines in mediating the bystander effect using HSV－TK xenogeneic cells〔J〕.Cancer Lett,1995,92(2)：167.
收稿日期：1998－04－02；修回日期：1998－11－24
用户登录 
新用户注册