大肠癌ColⅣ、LN及FN的免疫组化研究

中国肿瘤临床 2000年第4期第27卷 论著

作者：吴晓华　高奉浔　陈俐

单位：吴晓华　第三军医大学大坪医院野战外科研究所病理科(重庆市　400042)；高奉浔　第三军医大学大坪医院野战外科研究所病理科(重庆市　400042)；陈俐　第三军医大学大坪医院野战外科研究所病理科(重庆市　400042)

关键词：大肠癌；基底膜；免疫组化；浸润转移

　　摘要　目的：检测基底膜主要成分层粘连蛋白(LN)、纤维粘结蛋白(FN)及Ⅳ型胶原纤维(ColⅣ)在大肠癌中的表达以及与浸润、转移的关系。方法：免疫组化标记大肠癌组织中ColⅣ、LN及FN。结果：大肠癌组织中基底膜成分存在不同程度的缺失，表现为ColⅣ、LN呈不连续、片状分布；癌组织分化越低，LN缺失越明显；ColⅣ表达与组织类型有显著关系，而与分化程度无关。一般腺癌阳性率明显高于粘液腺癌及印戒细胞癌；DukesB、C期大肠癌ColⅣ表达阳性率低于A期大肠癌；FN表达与上述因素关系不大。结论：大肠癌基底膜成分的缺失与其侵袭、转移能力有关，尤其是ColⅣ的缺失可能标志其具较强的侵袭、转移能力。

　　Expression of Laminin,Fibronectin and Collagen Ⅳ

　　in Colorectal Carcinomas

Wu Xiaohua Gao Fengxun Chen Li

　　(Daping Hospital/Research Institute of Surgery, The Third Military Medical University, Chongqing)

　　AbstractPurpose: This study sought to determine if there is a correlation between the expression of major components of basement membrane such as collagen Ⅳ , fibronectin, laminin etc. and the invasion and metastasis of colorectal carcinomas.Methods: An immunohistochemical study of the major basement membrane antigen collagen Ⅳ , fibronectin and laminin was performed and 109 cases of colorectal carcinoma were observed.Results: There was a statistically significant correlation between the collagen Ⅳ expression and histologic type of colorectal carcinoma. The depletion of collagen Ⅳ was more prominent in mucinous carcinoma and signet carcinoma than that in adenocarcinoma, but no close correlation was found between the expression of collagen Ⅳ and the histologic stage of tumor. Only about 30％ of the stage B and stage C tumors expressed collagen Ⅳ . This percentage was slightly lower than that of stage A tumors. In addition, laminin or fibronectin expression did not show any significant association with these parameters mentioned above.Conclusion: The absence of the components of basement membrane especially the collagen Ⅳ is intimately associated with invasion and metastasis in the case of colorectal carcinomas.

　　Key Words Colorectal carcinoma Basement membrane Laminin Collage Ⅳ Invasion and metastasis Fibronectin

　　肿瘤浸润、转移是影响临床治疗效果的主要因素。基底膜作为宿主与癌细胞的重要屏障，在肿瘤浸润、转移中的作用日益受到人们的重视。已知基底膜主要由ColⅣ(typeⅣcollagen)、层粘连蛋白(Laminin，LN)、纤维粘结蛋白(fibronectin，FN)等组成。本实验采用免疫组化方法检测大肠癌浸润过程中基底膜上述几种主要成分的表达和分布情况，以期探明它们与大肠癌临床分期、组织类型、分化程度等的关系，探讨其在浸润、转移中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本

　　取自我院1990-1993年外科手术切除的大肠癌标本109例，经10％甲醛固定、石蜡包埋，作5μm连续切片。

　　1.2 临床病理分析

　　109例中，男性63例，女性46例；年龄19～77岁(平均51岁)；肿瘤位于直肠70例(64％)、乙状结肠8例(7.3％)，6例位于盲肠(5.5％)，升结肠及横结肠各5例(各占4.6％)，结肠肝曲7例(6.4％)、脾曲及降结肠各3例(2.8％)，2例为多个部位多发；肿瘤直径1.0～15cm(平均4.5cm)。

　　切片经HE染色，光镜观察，行组织学分类、分型、分级、Dukes分期等。

　　1.3 免疫组化

　　抗体：抗Ⅳ型胶原单克隆抗体(DAKO，1:100)，抗FN多克隆抗体(DAKO，1:400)，抗LN多克隆抗体(Sigma，1:1000)。ABC试剂盒(Vector，生物素标记二抗：1:200，ABC复合物：1:100)。蜡块经5μm连续切片，60℃脱蜡至水，ColⅣ组先经0.05％～0.1％胰蛋白酶37℃消化20分钟，LN组先经0.4％胃蛋白酶消化20分钟，各组分别按ABC法进行免疫组化染色，DAB显色，水洗后用苏木精复染。每批均设有阴性对照。

　　免疫组化染色结果分为阴性：癌组织周围无棕褐色阳性物质；弱阳性：癌组织周围有浅棕褐色或不连续的点、片状棕褐色阳性物质；强阳性：癌组织与正常组织交界处有棕褐色阳性物质环绕。

　　1.4 结果分析

　　对所有数据进行显著性检验。

　　2 结果

　　2.1 组织学分类与临床Dukes分期

　　见表1。

表1　大肠癌组织类型与Dukes分期(例)

　　腺癌的分化程度与Dukes分期有关(P＜0.05)，随着分化程度降低，DukesB、C期发生率越高，肿瘤侵袭越深。而粘液腺癌、印戒细胞癌及低分化腺癌间无明显差别(P＞0.05)。2.2 Ⅳ型胶原在正常粘膜LN与ColⅣ在大肠癌中的分布

　　正常粘膜Ⅳ型胶原主要分布于基底膜、粘膜肌层、肌层及脉管壁，呈棕褐色线状或片状(图1)；大肠癌基底膜普遍缺失或着色减弱，多为断续线、片状阳性(图2)，部分呈连续线、片状环绕。LN与ColⅣ在基底膜、基质中的表达分布基本一致，也发生不同程度的缺失，癌周组织表达呈弱阳性；FN分布较广，癌组织及癌周组织中普遍阳性，呈棕黄色较均匀片状，在各型癌组织中均未见到明显的缺失或增多情况。

图1　正常大肠粘膜Ⅳ型胶原分布于基底膜、粘膜肌层以及脉管壁，

　　呈棕色线状或片状ABC法×100

图2　大肠癌Ⅳ型胶原普遍缺失或着色减弱呈不连续、

　　片状分布ABC法×100

　　2.2.1 ColⅣ表达与组织类型、分化程度、Dukes分期如表2，3。

表2　大肠癌组织类型、分化程度与Ⅳ型胶原表　达(例)

表3　Dukes分期与Ⅳ型胶原表达(例)

　　大肠腺癌Ⅳ型胶原表达与分化程度无明显关系(P＞0.05)，但腺癌与粘液腺癌及印戒细胞癌间有显著差别(P＜0.05)(图3)，腺癌的阳性率明显高于后两者。随着肿瘤侵袭、转移，Col Ⅳ缺失有加重趋势(DukesB、C期大肠癌ColⅣ表达阴性率分别为73％及66％)，但与DukesA期比较无显著差别(P＞0.05)。

图3　印戒细胞癌Ⅳ型胶原缺乏更为明显

中除血管及纤维间质着色阳性外，

　　癌组织中Ⅳ型胶原表达几乎为阴性ABC法×200

　　2.2.2　本组LN表达与大肠癌组织类型、Dukes分期无明显关联(图4)；随着癌组织分化程度降低，LN表达有减弱趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。

图4　大肠癌组织中层粘连蛋白(LN)也有不同程度的缺乏

　　ABC法×200

　　本组FN分布较广，呈普遍阳性着色，在各型癌组织中均未见到明显的缺失或增多，FN标记与大肠癌组织类型、分化程度及Dukes分期关系不大。

　　3 讨论

　　基底膜是瘤细胞侵袭过程中遇到的主要屏障，为非细胞的细胞外结构。主要由ColⅣ形成一种三维网状结构，并与其它成分，如层粘连蛋白，纤维粘结蛋白等连接成为细胞外基质结构。癌细胞能分泌一些蛋白水解酶如Ⅳ型胶原酶，使局部基质溶解，形成突破口，进而实现浸润；另外，蛋白水解片段不仅可以促使癌细胞分泌更多的蛋白水解酶，还能诱导细胞的运动、迁移、增殖反应、血管生成及癌栓形成等一系列生物效应^[1～3]。王瑞年等^[4]观察到浸润生长的胃癌中LN、ColⅣ呈断续小片状表达甚至消失；David^[5]发现胃癌ColⅣ表达与组织类型和DNA含量有关；Hewitt^[6]证实在癌细?侵袭处胶原缺如，而癌组织中央部位胶原则较多，认为富含胶原的基质的产生(thedesmoplasticresponse)可以减弱癌细胞的侵袭活性；Offerhaus^[7]也认为大肠癌中Ⅳ型胶原的沉积提示良好的预后。本实验观察了大肠癌不同的组织类型、分化程度及临床分期与Ⅳ型胶原、LN及FN的表达情况，结果显示：大肠癌基底膜成分存在不同程度的缺失或不完整，表现为ColⅣ、LN呈不连续线、片状分布。大肠腺癌Ⅳ型胶原表达与组织类型相关，腺癌与粘液腺癌及印戒细胞癌间有显著差别，腺癌的阳性率明显高于后两者(P＜0.05)，Col Ⅳ表达与分化程度似无明显关系 (P＞0.05)；随着癌细胞侵袭、转移越严重、Dukes分期越高，ColⅣ缺失也有增多趋势，2/3以上的DukesB、C期大肠癌ColⅣ表达为阴性，提示：ColⅣ缺失的大肠癌可能更具侵袭性。反言之，恶性程度高，易发生淋巴结及远处转移的低分化腺癌、粘液腺癌及印戒细胞癌^[8]，其较强的侵袭性可能与ColⅣ缺失有关。

　　随着癌细胞分化程度降低，LN表达有减弱趋势，LN表达与组织类型Dukes分期无明显关联。本组FN标记则与大肠癌组织类型、分化程度及Dukes分期关系不大。

　　癌组织基底膜成分是由癌细胞保留了上皮细胞的功能而合成的，它们不断分解合成，其含量多少取决于癌细胞合成和分泌基底膜物质的能力、癌细胞和宿主细胞合成及分泌基质降解酶的能力，以及癌细胞和宿主细胞合成和分泌蛋白酶抑制物的能力。显然，基底膜成分的多少是机体与肿瘤矛盾双方作用的结果，与肿瘤的侵袭性密切相关。本实验显示，恶性程度越高，侵袭力越强的大肠癌，其癌周基底膜成分可能缺失越明显。ColⅣ可作为反映大肠癌侵袭、转移能力的指标。

　　本实验中FN分布广泛，各型癌组织中未见明显缺失或增多，可能与FN并非基底膜所特有的成分有关，它不仅存在于基底膜，同样也存在于组织间质结缔中。同时，也可能与使用抗体的特异性、敏感性有关。

　　此外，Ⅳ型胶原、LN、FN及其它基质成分、蛋白水解酶等在大肠癌发生发展过程中的详细机制，以及与临床预后等的关系，尚待进一步深入研究。

　　参考文献

　　［1］Herbst TJ. Differential effects of laminin, intact type Ⅳ collagen and specific domains of type Ⅳ collagen on endothelial cell adhesion and migration. J Cell Biol, 1988;106:1365～ 73

　　［2］Humphries MJ, Ayad SR. Stimulation of DNA synthesis by cathepsin D digests of fibronectin. Nature, 1983;305:811～3

　　［3］Aznavoorian S, Murphy AN, Stetler－ Stevenson WG, et al. Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis. Cancer, 1993;71:1368～83

　　［4］王瑞年,朱延波,薛建元,等.胃癌浸润转移与整合蛋白、Ⅳ型胶原酶及细胞外基质的关系.中华病理学杂志,1994;23(5):278～81

　　［5］David L, Nesland JM, Holm R, et al. Expression of laminin,collagen Ⅳ , fibronetin and type Ⅳ collagenase in gastric carcinoma. An immuno－ histochemical study of 87 patients. Cancer, 1994;73:518～27

　　［6］Hewitt RE, Powe DG, Carter GI, et al. Desmoplasia and its relevance to colorectal tumour invasion. Int J Cancer,1993;53:62～9

　　［7］Offerhaus GJ,Giardiello FM, Bruijn J,et al. The value of immunohistochemistry for collagen Ⅳ expression in colorectal carcinomas. Cancer, 1991;67:99～105

　　［8］Hewitt RE,Powe DG, Carter GI, et al. Basement membrance collagen－Ⅳ synthesis in colorectal tumours. Int J Cancer,1992;51:530

(1999－04－12收稿)