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大肠癌人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的关系

大肠癌乳头瘤病毒感染与p53基因突变的关系

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 简报

作者:李世拥 于波 安萍 马怡红 梁振家 苑树俊

单位:100700 北京军区总医院普通外科

  我们采用PCR、PCR-SSCP技术,对大肠癌组织中乳头瘤病毒(HPV)感染与p53基因突变进行分析,旨在探讨大肠癌发生与HPV感染和p53基因突变的关系,现报道如下。

  一、对象与方法

  1. 标本 我院1996年~1997年经手术切除大肠癌病50例。术中切取新鲜癌灶标本立即置入液氮中贮存。术后均经病理组织学证实。高分化腺癌8例,中分化腺癌21例,低分化腺癌12例,粘液腺癌9例。

  2. 组织中DNA的提取采用裂解液消化后,用酚-氯仿抽提DNA,无水乙醇沉淀,体积分数为75%乙醇洗涤,凉干,以三蒸水溶解DNA。

  3. HPV检测 HPV反应体系,25 μl反应体系中含DNA模板5 μl,PCR反应液20 μl,Taq酶1 U。引物: HPV16、18晚期区共同引物,扩增片段为449 bp。HPV 16、18早期区特异引物,扩增片段分别为203 bp,244 bp。以上引物均由(北医大病理分子生物学实验室合成)。PCR反应: 94℃/45″、55℃/1′、72℃/1′,共35个循环。以电泳观察:制备1.2%琼脂糖凝胶,电泳后于紫外光透射下观察相应条带。

  4. p53基因PCR-SSCP分析:反应体系同上。引物: p53基因第5、6、7、8、9外显子引物,(均由京师生物工程技术公司合成)其扩增片段分别为181bp、201bp、171bp、204bp、185bp。PCR反应:第5、6、7、8外显子为94℃/45″、56℃/45″、72℃/45″、第9外显子火温度为46℃/45″。共35个循环。SSCP检测:取10μl PCR产物,经热变性后上样于8%聚丙烯酰胺凝胶,垂直电泳,银染、显色后观察,出现异常条带者即为有突变。

  二、结果

  1. 50例标本中,检出有HPV16、18DNA相关序列者26例占52%,其中HPV16DNA4占例8.0%,HPV18

  DNA22例占44.0%。两者检出率差异有非常显著性(P<0.01)。

  2. 50例标本中,共检出有p53基因突变者28例,占56.0%。其中第5外显子突变3例,第6外显子突变4例,第7外显子突变6例,第8外显子突变13例,第9外显子突变2例。第8外显子突变率较高(P<0.05)。

  3. 在26例HPV18、16DNA检测阳性者中,出现p53基因突变者19例,占73.1%。而在HPV18、16DNA阴性的24例中,有p53基因突变者9例,占37.5%。两组中p53基因突变率差异有显著性(P<0.05)。

  三、讨论

  近年来的研究表明HPV感染与肺癌、宫颈癌的关系已被确认[1]。1990年Kirgan等[2,3]首次发现97%的结肠癌中有HPV壳抗原存在,经原位杂交分析显示约1/3壳抗原阳性组织存在HPV DNA。本组发现高危型HPV16、18DNA检出率为52%。其中HPV18DNA检出率为44%,表明HPV感染与大肠癌的发生有密切关系。

  本实验结果发现,p53基因突变率为56%,然而高危型HPV16、18DNA序列检出阳性者中,出现p53基因突变占73.1%,提示高危型HPV16、18 DNA相关序列与p53基因突变呈正相关关系。原因可能在于高危型HPV18、16E6蛋白与p53蛋白结合,可使野生型p53蛋白降解,E6蛋白与野生型p53蛋白结合抑制其负性调节作用;HPV、DNA经插入方式整合到染色体的某些位点,可致p53突变,突变的p53活性丧失,而出现促恶性转化活性;HPV蛋白产物E7蛋白作用锌离子结合区,影响其反式激活及转化活性[4,5]。但多数的证据表明高危型HPV感染与大肠癌发生有密切关系,HPV本身可能尚不足以诱导肿瘤的发生,而是与宿主p53基因突变相互作用。本组高危型HPV16、18 DNA感染者中p53基因突变占73%的结果显示了高危型HPV16、18DNA感染与p53基因突变之间,在肿瘤发生中可能相互起着协同作用。当然,大肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。但对高危型HPV感染可能成为大肠癌发生的重要因素之一。

  参考文献

  1 Furihate M, ohtsuki Y, Ogoshi S, et al. Prognostic significance of human papillomavirus genomes (type-16,18) and oberrant expression of p53 protein in human esophageal cancer.Int J Cancer, 1993,54:226-227.

  2 Kirgan D, Manalo P,Hall M, et al. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Surg, 1990,125:862-863.

  3 Kirgan D, Manalo P,cGregor M B. Immunohistochemical demonstration of human papillomavirus antigen in human colon neoplasms.J Surg Res, 1990,48:397-398.

  4 Vousden KH, Vojtesek B, Fisher C, et al. HPV-16 E7 or adenovirus E1 A can overcome the growth arrest of cells immortalized with a temperature-sensitive p53. Oncogene, 1993,8:1697-1698.

  5 Miranda T,paola M, John J, et al. HPV-18 E6 mediated inhibition of p53 DNA binding activity is independent of E.induced egradation. Oncogen, 1995,10:261-262.

(收稿:1998-04-09 修回:1998-10-23)


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