凋亡相关基因在非小细胞肺癌组织中表达的研究

中华结核和呼吸感染 1999年第11期第22卷 论著

作者：魏卫　尹学哲　金河凤　曹东铉　陈菊荣

单位：魏卫　尹学哲　金河凤　133000 吉林省延吉市，延边大学医学院附属医院呼吸内科 曹东铉　病理科 陈菊荣　徐州市第四人民医院病理科

　　关键词： 肺肿瘤；细胞凋亡；基因表达免疫组织化学

　　【摘要】　目的　探讨bcl-2、bax、Fas、FasL凋亡相关基因在非小细胞肺癌中表达及与肿瘤临床病理学的关系。方法　采用免疫组织化学方法检测45例非小细胞肺癌中bcl-2、bax、Fas和FasL的表达。结果　23例（51%）bcl-2阳性，38例（84%）bax阳性（P＜0.01）,二者之间表达无明显关系，但Fas与FasL之间表达呈正相关（P＜0.01）。bcl-2蛋白表达率随肿瘤期别进展而降低（P＜0.05），bax蛋白在低分化癌中表达减少（P＜0.05），FasL在肺腺癌细胞中表达较高（P＜0.01）。bcl-2和bax蛋白同时表达阳性与肺癌TNM分期显著相关（P＜0.05），bcl-2蛋白单一表达与细胞分化有关（P=0.033）。结论bcl-2、bax、Fas和FasL可能通过不同途径参与了非小细胞肺癌组织中细胞凋亡的调节，并在肿瘤的发生与发展中发挥重要作用。

Study on expression of apoptosis related genes in non-small cell lung carcinoma

WEI Wei, YIN Xuezhe, JIN Hefeng, et al.

　　Department of Respiratory Medicine, Affiliated Hospital of Yanbian University College of Medicine, Yanji 133000

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between the expression of apoptosis related genes in the tissue of non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and clinicopathology in the tumor.Methods　The expression of bcl-2, bax, Fas and FasL were detected with immunohistochemistry method in 45 cases of NSCLC.Results　23(51%) cases of NSCLC were bcl-2 positive, 38 (84%) were bax positive (P＜0.01), and there was no significant correlation between the expression of bcl-2 and bax protein, but a positive relationship was found between the expression of Fas and FasL (P＜0.01). The positive rate of bcl-2 expression decreased in advanced stages of NSCLC(P＜0.05),the bax expression was lower in cases with poor cell differentiation (P＜0.05),and the FasL expression was higher in adenocarcinoma (P＜0.01). The simultaneous expression of bcl-2 and bax protein was closely correlated with TNM stages (P＜0.05), the differences of bcl-2 protein expression alone in NSCLC with cell differentiation were statistically significant (P=0.033).Conclusions　Both bcl-2, bax, Fas and FasL may involve in the regulation of apoptosis and may play an important role in the occurrence and progression of NSCLC.

　　【Key words】　Lung neoplasm　　Apoptosis　　Gene expression　　Immunohistochemistry

　　细胞凋亡(apoptosis)是一种由凋亡相关基因调控的细胞自身程序化死亡，它是机体维持正常细胞数量在组织器官中生长与死亡之间动态平衡的重要机制。近年研究表明，肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病，也是凋亡异常的疾病，凋亡状态及其调控基因的异常，可导致细胞生态平衡紊乱，参与肿瘤的发生、发展^［1］。在bcl-2基因家族中，bcl-2是凋亡抑制基因，bax是凋亡诱导基因，二者比率是影响细胞凋亡的关键。Fas及其配体FasL相互作用也是细胞凋亡的重要途径之一。我们采用免疫组织化学方法对45例非小细胞肺癌(NSCLC)进行bcl-2、bax、Fas和FasL基因表达产物检测，探讨其与肿瘤临床病理特征的关系。

　　材料与方法

　　一、材料

　　为手术切除存档石蜡标本，取自1996年6月～1998年2月本院收治的临床病理资料完整的45例NSCLC。其中男37例，女8例；年龄21～76岁，平均年龄57.2岁。按WHO 1981年肺癌组织学分类标准进行组织学分类：鳞癌30例，腺癌15例；高分化癌15例，中分化癌22例，低分化癌8例。按国际抗癌联盟(UICC)1997年肺癌国际分期修正标准^［2］进行TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期16例，Ⅲ_a期13例，Ⅲ_b期8例。所有患者术前均未做放、化疗。标本均新鲜取材，以100 g/L中性甲醛固定，常规脱水包埋，4 μm厚连续切片，分别作HE染色及bcl-2、bax、Fas和FasL免疫组织化学染色。

　　二、方法

　　免疫组织化学采用链酶亲合素生物素复合物(SABC)法加微波修复。实验用鼠抗人bcl-2（Ab-1）单克隆抗体为美国Calbiochem公司即用型产品，兔抗人bax(N-20)、Fas(C-20)和FasL(N-20)多克隆抗体均为美国Santa Cruz公司即用型产品，HIGH-SABC免疫组化染色试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德公司。具体步骤严格按说明书操作，用已知阳性标本作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　在光镜下观察免疫组织化学染色结果，4种蛋白均表达于胞浆和（或）胞膜，染色阳性信号呈棕黄色颗粒。数5个以上高倍视野，不少于1 000个肿瘤细胞，计数阳性细胞数并以百分比表示，以阳性细胞数超过10%判断为阳性。统计学处理采用χ²检验和四格表确切概率法。

　　结果

　　一、bcl-2和bax蛋白在NSCLC中的表达

　　45例NSCLC中bcl-2阳性表达23例（51%），bax阳性表达38例（84%），二者阳性表达率比较有显著性差异（χ²=11.45, P＜0.01）。Ⅰ、Ⅱ期bcl-2蛋白表达状况与Ⅲ期比较，高、中分化癌bax蛋白表达状况与低分化癌比较均有显著性差异（P＜0.05，表1），但二者表达与性别、年龄、组织类型的关系均无统计学差异。

表1　4种基因表达产物与NSCLC临床病理特征的关系

　　注：^*Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ_a、Ⅲ_b比较，χ²=4.98，P＜0.05；^**高、中分化与低分化比较，χ²=5.89，P＜0.05；^△肺鳞癌与肺腺癌比较，χ²=6.86，P＜0.01；文中括号前数字为阳性表达例数，括号内为百分率　　本组bcl-2和bax同时阳性表达18例，同时阴性表达2例，二者之间表达无相关性，但二者相互表达与NSCLC组织分化、分期有关（表2）。

表2　bcl-2和bax蛋白同时表达与NSCLC组织分化程度、分期的关系

　　注：^*Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ_a、Ⅲ_b比较，χ²=4.30，P＜0.05；^**高、中分化与低分化比较，P=0.033；^△bcl-2表达状态/bax表达状态；文中括号前数字为例数，括号内为百分率　　二、Fas和FasL在NSCLC中的表达

　　45例NSCLC中Fas阳性表达18例(40%)，FasL阳性表达14例(31%)。FasL在肺腺癌中表达阳性率为60%（9/15），显著高于在肺鳞癌中的阳性表达率17%（5/30）(P＜0.01，表1)，而Fas表达率未见这种组织类型差异，两种蛋白表达与性别、年龄、组织分化程度以及TNM分期均无关。

　　本组Fas+/FasL+ 14例，Fas-/FasL-27例，二者之间表达具有正相关性（r=0.82,P＜0.01）。

　　讨论

　　现有的研究表明，肺癌的发生、发展和转移是一个极其复杂的多基因调控异常的过程。肺癌不仅与细胞异常增殖有关，亦涉及细胞异常死亡，与细胞凋亡关系密切的基因主要有p53和bcl-2以及Fas/FasL系统。癌基因bcl-2是新近发现的一种抑制细胞凋亡的基因，它的过度表达延长了细胞存活时间，增加了其它癌基因表达的机会，同时还保护发生基因突变的细胞长期生存而不凋亡，但对细胞的增殖速度不产生影响^［3］。在某些肿瘤中，肿瘤的分裂增生反而低于正常组织细胞，肿瘤的不断生长只是由于肿瘤细胞的寿命延长^［4］。体外bcl-2能抑制包括p53等多种因素诱导的细胞凋亡，但体内则与其家族成员bax形成异源或同源二聚体，bax基因在功能上与bcl-2相反，具有拮抗bcl-2抑制凋亡作用，二者数量比决定促进或抑制凋亡，即bcl-2占优势时细胞生存，而bax占优势时细胞凋亡^［5］。Fas和FasL分别为细胞膜Ⅰ型和Ⅱ型糖蛋白，Fas的功能为受体功能，当其与天然配体FasL结合后即发出凋亡信号，导致表达Fas的细胞发生凋亡^［6］。近年来，许多研究已经证实肿瘤细胞膜有Fas和（或）FasL表达^［7，8］，其FasL能与浸润肿瘤的T淋巴细胞的Fas结合，启动T细胞内凋亡信号，通过凋亡从而清除T细胞；肿瘤细胞还可以主动减少Fas受体表达，避免了T细胞FasL的攻击作用，并且可能通过Fas突变，降低其表面Fas受体对T细胞FasL的敏感性，从而使癌细胞逃避机体免疫机制，促进肿瘤的生长和转移。

　　目前，对bcl-2基因表达产物与肺癌的一些临床病理特征诸如TNM分期、组织类型、细胞分化程度以及预后等的关系看法不一^［9-12］，这可能是由于病例选择、实验方法、判断标准的不同所致。但bcl-2和bax基因的异常表达变化在一定程度上反映了肺癌发生、发展过程中细胞稳定状态的失衡，因而与肺癌生物学行为和预后相关。bcl-2和bax是一对作用相反的基因，Brambilla等^［13］对肺神经源性肿瘤细胞凋亡、凋亡相关基因表达的研究表明，bcl-2和bax表达呈显著负相关（P＜0.0001），而本组的研究结果未提示NSCLC中存在这种关系。我们研究发现，bcl-2和bax蛋白表达变化出现在肺癌平衡失调阶段：bcl-2在Ⅰ、Ⅱ期癌中阳性表达明显高于Ⅲ期癌，这也见于bcl-2和bax同时阳性表达者（P＜0.05）；分化较好的癌，bax高表达者占92%，随着肿瘤细胞分化降低而逐渐丧失表达（P＜0.05），bcl-2和bax共同阳性表达者亦存在这种趋势，但无统计学差异；在高、中分化癌bcl-2阳性且bax阴性表达显著低于低分化癌（P=0.033）。bcl-2和bax蛋白在肺癌组织中出现异常表达，并可能通过细胞凋亡调控机制参与肺癌的发生与发展。本研究结果亦显示NSCLC组织中Fas、FasL的表达呈正相关（P＜0.01），我们认为虽然肺癌细胞可以表达Fas受体，激活T细胞的FasL并与之结合，但不能启动凋亡，而癌细胞膜FasL反能结合于激活T细胞的Fas受体，使T细胞凋亡，从而引起肿瘤细胞的恶性增殖。Fas/FasL系统可能通过不同凋亡途径在肺癌细胞逃避机体免疫方面发挥重要作用。FasL在肺腺癌的表达阳性率显著高于肺鳞癌（P＜0.01），推测FasL表达具有较恶的生物学行为，FasL阳性的肿瘤细胞更易发生转移或转移后更易生长。bcl-2家族基因与Fas/FasL系统的关系以及能否成为临床上判断肺癌生物学行为及预后的有效指标，有待更多的研究证实。

　　作者简介：魏卫 研究生

　　 参考文献

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(收稿：1999-03-16)