小细胞肺癌肿瘤标志物——胃泌素释放肽前体酶联免疫检测方法的研究进展

　　军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

周明非　张贺秋　凌世淦

　　摘　要　介绍一种新的小细胞肺癌的肿瘤标志物。用基因重组的人胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide，ProGRP)制备单克隆抗体和抗血清，建立ProGRP的双抗体夹心酶联免疫检测（ELISA）方法。临床实验研究显示该检测方法对小细胞肺癌诊断的特异性高，对早期小细胞肺癌也有较高的阳性率，检测的可靠性也很高。各种临床实验结果也证明，ProGRP是临床诊断和鉴别诊断小细胞肺癌的良好的肿瘤标志物，而且ProGRP比神经元特异烯醇化酶更适宜用于小细胞肺癌的早期诊断。新近有学者发现在需要血液透析的慢性肾功能衰竭患者中有96%血清ProGRP超过临界值。因此在临床应用ProGRP免疫检测作为小细胞肺癌的诊断和判断疗效和复发时，必须检查患者的肾功能以排除慢性肾功能衰竭所出现的血中ProGRP的升高。

　　关键词：胃泌素释放肽前体；癌，燕麦细胞；酶联免疫吸附测定；神经元烯醇化酶；肾功能衰竭，慢性

　　肺癌是近年来发病率日趋增高的恶性肿瘤之一。在各种肺癌中，小细胞肺癌约占30%，小细胞肺癌对复合化疗和放疗高度敏感，早期发现经及时治疗有治愈的可能。因此可靠的小细胞肺癌标志物及其检测方法对临床治疗有重要作用。

　　最早McDonald等^［1］从猪的胃组织中分离出一种具有促胃泌素分泌作用的胃泌素释放肽（gastrin releasing peptide,GRP），是由27个氨基酸组成的肠脑肽。GRP与肺癌的关系是在人胚胎肺的分泌细胞中发现存在蛙皮素（bombesin）免疫活性后于同年开始被认识^［2］。其后，Yamaguchi等^［3，4］证明GRP是小细胞肺癌组织的重要产物。继而研究证明血液中GRP是小细胞肺癌的重要肿瘤标志物，有72%的小细胞肺癌患者血清中GRP呈现高值。但由于GRP活性部分在血中不稳定，而且从血浆中提取可靠的GRP较困难，因而难以在临床上用于常规检测。日本国立肿瘤研究中心Yamaguchi领导的课题组根据小细胞肺癌的生物学研究成果，开发出新的小细胞肺癌的增殖因子胃泌素释放肽前体（pro-gastrin-releasing peptide,ProGRP）^［5］。ProGRP是一种新的小细胞肺癌的肿瘤标志物，普遍存在于非胃窦组织、神经纤维、脑和肺组织的神经内分泌细胞中。

　　ProGRP是GRP的前体结构，根据其部分氨基酸的变异可分为3种生物大分子。将这3种ProGRP分子的C端序列中的共同部分（31-98）用基因工程技术进行重组，即利用DNA合成仪合成ProGRP（31-98）基因片段，将所合成的基因片段插入表达载体pATTrp的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，转化E.coli后所表达的ProGRP（31-98）为N端含TrpE蛋白17个氨基酸残基的融合蛋白。用纯化后的重组蛋白制备单克隆抗体和抗血清，建立抗ProGRP的双抗体（单抗和多抗）夹心酶联免疫检测系统。此免疫检测系统对247例健康人对照，20例非恶性肿瘤肺疾病（肺炎、肺脓肿、间质性肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张和肺死骨形成），20例非小细胞肺癌患者（8例肺腺癌、7例鳞癌、5例大细胞癌）和25例未经治疗的小细胞肺癌患者的血清样品进行验证，结果健康人对照和非恶性肿瘤肺疾病和非小细胞肺癌的血清ProGRP的浓度均低于45.1 ng/L，阳性率分别为0.4%（1/247），0%（0/20）和5%（1/20）。在小细胞肺癌患者中，局限型的血清ProGRP阳性率为66.7%（8/12），血清浓度为861.9 ng/L,超过健康人68倍；扩散型为76.9%（10/13），浓度为1645.0 ng/L，是健康人的130倍^［6］。由此可见，此方法对小细胞肺癌的诊断特异性高，在早期小细胞肺癌患者也有较高的阳性率，检测可靠性也很高。

　　关于ProGRP酶联免疫检测法在小细胞肺癌临床诊断中应用价值已较肯定^［7］。日本学者久保田馨等也曾报告以1986～1991年间就诊日本国立疗养所松户医院的133例小细胞肺癌患者，427例非小细胞肺癌患者，177例良性肺疾病患者以及247例健康者为观察对象测定血清ProGRP浓度，结果发现，小细胞肺癌组的敏感性为67.7%（其中局限型为62.7%，进展型为71.6%），腺癌组为1.7%，鳞癌组为2.6%，大细胞癌组为2.9%，良性肺疾病组为0.6%，提示小细胞肺癌组血清ProGRP浓度及其敏感性均明显高于其他患者组。ELISA检测小细胞肺癌组的特异性和准确率分别为97.7%和90.7%。新近，Goto等^［8］也报道，206例小细胞肺癌患者血清ProGRP阳性率为68.0%，而544例非小细胞肺癌患者的阳性率仅为4.2%。由此可确认，ProGRP是临床上诊断和鉴别诊断小细胞肺癌的良好指标。

　　另据文献报道^［9，10］，ProGRP与神经元特异烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）两种肿瘤标志物在小细胞肺癌患者血清中浓度水平的对比分析研究表明：在正常健康人（844人）血清ProGRP超过临界值者仅两例（0.2%），NSE为3例（0.4%）；小细胞肺癌患者（127例），血清ProGRP超过临界值者为80例（63.0%），NSE为79例（62.2%），而非小细胞肺癌中的阳性率不超过3.7%，提示这两种肿瘤标志物在诊断和鉴别诊断小细胞肺癌中的作用相似；但不同的是，小细胞肺癌患者血清中ProGRP的平均测定值为1547.8 pg/ml，是临界值46.0 pg/ml的34倍；而小细胞肺癌患者血清中NSE的平均测定值为22.5 ng/ml，是临界值(6.4 ng/ml)的3.5倍。最近Stieber等^［11］也比较研究了272例肺癌（87例小细胞肺癌，185例非小细胞肺癌）患者血清 proGRP，NSE和细胞角质蛋白19片段（cytokeratin-19 fragment,CYFRA21-1）浓度水平，并用74例良性肺疾病和吸烟者的血清作为对照参考，ProGRP的检测结果与前面基本相同，而且很少出现“假阳性”。在非小细胞肺癌，其首位标志物CYFRA21-1的敏感性为63%。因而证明，ProGRP是更为理想的易于判定的小细胞肺癌的肿瘤标志物。其次，在不同的临床试验中，大量病例分析结果还显示^［7］，Ⅰ、Ⅱ期小细胞肺癌的ProGRP的阳性率分别为35.5％和50％；而NSE阳性率分别为15.4%和17.6%。因此，ProGRP比NSE更适宜用于小细胞肺癌的早期诊断。

　　小细胞肺癌的临床治疗效果与血清中ProGRP浓度变化的随访观察研究表明^［12］，在39例小细胞肺癌患者治疗已完全痊愈病例中，治疗后血清ProGRP已全部降至临界值以下；部分痊愈者约半数降至临界值；而恶化病例则可检测到呈上升趋势。Okusaka等^［13］比较观察和判断小细胞肺癌患者（44例）血清ProGRP和NSE与病情变化关系的临床研究结果显示，ProGRP和NSE的ELISA检测的敏感性和特异性相近。经化疗或化疗结合放疗获得部分缓解的患者中，有39%在复发后血清ProGRP的水平再度升高，而37%血清中NSE的水平也升高。而当部分缓解患者血清ProGRP水平低于临界值时，其缓解后生存期显著长于持续高水平ProGRP的缓解患者。18例经治疗后获得完全缓解或部分缓解的初治患者的复发，其中临床证实复发前血清ProGRP水平升高者有16例（89%），而血清中NSE水平升高者仅7例（37%），前者显著高于后者。此外，血清中ProGRP水平的升高比临床上通过物理检测和影像学验证提前约35 d，而NSE水平的升高都在临床发现复发证据后的20 d。最近Sunaga等^［14］又进一步研究比较了原发性肺癌患者血清中ProGRP与NSE的特异性和敏感性，并获得相类似的结果。与此同时，还在随访的29例小细胞肺癌患者中发现18例有效者在治疗后血清ProGRP水平明显下降，而11例无效者治疗前后无明显差异，9例复发者ProGRP水平再次上升；17例患者治疗后的ProGRP水平低于治疗前水平的50%，其存活期明显长于超过50%者。上述研究结果表明，治疗过程中和治疗后定期进行血清中ProGRP浓度的测定，有助于临床治疗效果的判断和复发的早期发现。

　　Kamata等^［15］报道，在肾功能衰竭患者中常显示血清中ProGRP水平的升高。该实验研究对象为正常健康人（16例）、小细胞肺癌（16例）、糖尿病（16例）、风湿性关节炎（10例）、红斑狼疮（12例）、慢性肾小球肾炎（14例）以及需要血液透析的慢性肾衰竭患者（26例）。结果表明，在肾功能正常的健康人和糖尿病、风湿性关节炎、红斑狼疮和慢性肾小球肾炎患者血清中ProGRP的浓度均低于46 ng/L；而小细胞肺癌患者血清中ProGRP的浓度均超过46 ng/L，平均浓度高达(1836±4 375)ng/L，16例中有10例（63%）ProGRP浓度大于290 ng/L。值得关注的是，在26例需要血液透析的慢性肾衰竭患者中有25例（96%）血清ProGRP浓度超过46 ng/L，患者在初次血液透析前后血清中ProGRP最高值分别为183和290 ng/L，平均值为(150±69)ng/L。随后，Nakahama等在测定42例需要血液透析和30例能走动的连续腹腔透析的慢性肾功能衰竭患者血清的ProGRP水平时,也证实前者ProGRP超过临界值(46.0 ng/L)的占90%［平均值为(107±59.4)ng/L］；而后者也占93%［平均值为(112.4±44.5)ng/L］。因此，在应用ProGRP免疫检测作为小细胞肺癌的诊断方法或作为临床判断疗效和是否有复发的监视标志时，必须同时检查患者的肾功能，以排除因慢性肾功能衰竭所出现的血中ProGRP浓度的升高。

　　综上所述，ProGRP是一种新的小细胞肺癌的肿瘤标志物。它不仅可用于小细胞肺癌的早期诊断，而且有助于判断治疗效果和肿瘤复发的早期发现，有着较高的临床实用价值。

　　［作者简介］周明非（1958～），男，北京人，助理研究员,硕士。

　　周明非(北京基础医学研究所，北京　100850)

　　张贺秋(北京基础医学研究所，北京　100850)

　　凌世淦(北京基础医学研究所，北京　100850)

　　参考文献

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