基因扫描分析非小细胞肺癌病人外周血和骨髓T细胞克隆性增殖及分布特点
癌症 2000年第3期第19卷 基础研究
作者:吴一龙 杨学宁 李锦添 王思愚
单位:吴一龙(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060);杨学宁(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060);李锦添(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060);王思愚(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060)
关键词:T细胞受体;Vβ基因;T细胞克隆;非小细胞肺癌
摘 要:目的:分析非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)病人的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性增殖特点。方法:利用RTPCR和基因扫描方法分析3例NSCLC外周血和骨髓单个核细胞中24个TCRVβ基因的CDR3长度,了解TCRVβT细胞的分布及其克隆性。结果:3例病人仅存在1~5个TCRVβ亚家族,主要为Vβ3、Vβ7和Vβ9,2例病人出现Vβ7寡克隆性增殖T细胞,另1例发现Vβ3的寡克隆T细胞。结论:NSCLC病人外周血或骨髓的TCRVβ亚家族出现倾斜性分布和克隆性增殖T细胞,主要为Vβ3和Vβ7亚家族T细胞,这可能是由肺癌细胞相关抗原引起的特异性免疫反应的T细胞克隆。
分类号:R371.2;R734.2 文献标识码:A
文章编号:1000-467X(2000)03-0204-04
The feature of clonal expansion and distribution of TCR VβT cells
from peripheral blood and bone marrow in patients with NSCLC
WU Yi-long YANG Xue-ning LI Jin-tian et al.
(Lung Cancer Research Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P.R.China )
Abstract:Objective: To investigate the distribution and clonal expansion of TCR Vβ subfamily T cells in patients with non small cell lung cancer (NSCLC). Methods: The CDR3 size of TCR Vβ 24 subfamily genes were analyzed in peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from 3 cases with NSCLC using RT-PCR and genescan, to evaluate the distribution and clonality of TCR Vβ T cells. Results: Only 1~ 5 Vβ subfamily T cells could be identified in NSCLC cases, the Vβ subfamily T cells main expressed were Vβ 3, Vβ 7 and Vβ 9. Vβ 7 oligoclonal T cells were identified in two cases, whereas Vβ 3 oligoclonal T cells were detected in the other case. Conclusions: The skew distribution and clonal expansion of TCR Vβ subfamily T cells could be found on patients with NSCLC, predominantly in Vβ 3 and Vβ 7. It may be the T cell clones for specific immune response due to the lung cancer cells associated-antigen.
Key words:NSCLC; T cell receptor; Vβ gene; T cell clonality▲
T细胞受体(Tcellsreceptor,TCR)是T细胞表面识别和结合抗原、参与特异性细胞免疫的重要分子。在T细胞发育过程中,其可变区(V)、多样区(D)和结合区(J)的基因片段进行重排,重排时在V-D,D-J区连接之间可有不同数量的核苷酸随机插入(N区),形成具有高度多样性的可变化区VβNDβNJβ,称为互补决定区(CDR3)[1]。同一克隆T细胞重排后,其CDR3长度和序列完全相同,而不同克隆T细胞的CDR3长度和序列有所不同,其长度的差别可为3~24个碱基,对CDR3长度和序列的分析,可以作为判别T细胞克隆性的指标[1]。利用RT-PCR和基因扫描方法分析TCRVβ24个亚家族的CDR3长度确定T细胞克隆性是国外近年开展的新方法[2],用于分析肿瘤病人外周血或肿瘤组织浸润性T细胞中的克隆性增殖T细胞情况,借此深入了解机体对肿瘤细胞相关抗原的特异性反应情况[2,3]。本研究利用该方法分析3例NSCLC病人外周血和骨髓TCRVβT细胞的分布及其克隆性。
1 材料和方法
1.1 样本
经病理确诊的NSCLC病人3例,其中肺鳞癌2例(L1、L2),肺腺癌1例(L3)。细胞株Molt-4和Jurkat作为单克隆对照,10例正常人作为多克隆对照,B细胞株Raji作为阴性对照。骨髓取自手术中所切的部分肋骨,外周血和骨髓单个核细胞的分离按常规方法进行。
1.2 RNA提取和cDNA合成
RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco,BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(SuperscriptII,Gibco,BRL)反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。
1.3 引物
用于非标记PCR的24个Vβ引物和一Cβ引物,用于runoffreaction的5’端荧光素标记的Cβ-fam引物和用于序列分析的5’端生物素标记的Cβ-bio引物均由德国柏林TIBMOLBIOL公司合成。引物的核苷酸序列见表1[2,4]。
表1 用于TCRVβPCR的引物的序列
Primer |
Sequence |
Vβ1 |
5'-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC |
Vβ2 |
5'-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA |
Vβ3 |
5'-CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC |
Vβ4 |
5'-TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA |
Vβ5 |
5'-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC |
Vβ6 |
5'-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG |
Vβ7 |
5'-CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC |
Vβ8 |
5'-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC |
Vβ9 |
5'-TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC |
Vβ10 |
5'-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC |
Vβ11 |
5'-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA |
Vβ12 |
5'-TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC |
Vβ13 |
5'-CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA |
Vβ14 |
5'-GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC |
Vβ15 |
5'-CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG |
Vβ16 |
5'-GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG |
Vβ17 |
5'-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC |
Vβ18 |
5'-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA |
Vβ19 |
5'-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA |
Vβ20 |
5'-AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC |
Vβ21 |
5'-TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT |
Vβ22 |
5'-AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA |
Vβ23 |
5'-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA |
Vβ24 |
5'-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC |
Cβ |
5'-CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG |
CβFam |
5'-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG |
1.4 RT-PCR
PCR按所报道的方法进行[2,4]。总反应体积为25μl,其中含1μlcDNA,任一Vβ引物(24个Vβ引物之一)和Cβ引物(0.5μmol),0.1mmoldNTP,1.25UTaq聚合酶(PerkinElmer)和1×PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪(PerkinElmer)中进行。共进行40循环,每一循环包括:94℃、1min(首次3min),60℃、1min和72℃、1min(末次10min),PCR产物保存于4℃中备用。
1.5 T细胞克隆性分析
1.5.1 Runoffreactions(标记PCR产物):10μl的反应体系含2μl的未标记的PCR产物、0.1μMCβfam引物、3mmolMgCl2,0.2mmoldNTP,0.25UTaq聚合酶和PCR缓冲液(PerkinElmer)。PCR共进行35循环,退火温度为66℃,余同上[4]。
1.5.2 基因扫描分析(CDR3长度分析):有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的PCR产物(2μl)加入2.5μl甲酰胺,0.5μlGenescan-500Tamra分子量标准品(ABI,PerkinElmer)和0.5μl加样缓冲液(Dextran50mg/ml,EDTA25mmol,Genescan-500TamraKit),经94℃、4min变性后,于6%聚丙酰胺凝胶中电泳,经373ADNA序列仪(ABI,PerkinElmer)的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光素强度。
1.5.3 结果判定:由于Vβ和Cβ引物是固定的,故Vβ/Cβ所扩增的PCR产物的大小决定于Vβ-Dβ、Dβ-Jβ之间重排时的连接片段N区和Dβ的长短,即VβNDβNJβ(CDR3),不同的T细胞克隆的PCR产物长度和含量有所不同,通过PCR产物的状况,便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过基因扫描软件分析,电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量;峰的形态提示产物的均一性(克隆性),当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时,电泳时,其迁移率完全相同,故在同一时间点通过扫描探头,所显示的结果为一单峰图象,提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞,即单克隆的细胞;而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性;而多峰图象提示多克隆性[4,5]。2 结果
2.1 TCRVβ亚家族T细胞的表达情况
RT-PCR扩增结果:3例病人外周血和骨髓分别存在1~5个Vβ亚家族(表2),正常人表达所有的24个TCRVβ亚家族,Molt-4和Jurkat细胞则均为表达单一TCRVβ的T细胞,分别为Vβ2和Vβ8T细胞。B细胞株Raji不表达任何TCRVβ基因。
表2 RT-PCR和基因扫描分析TCRVβ亚家族
T细胞克隆性的结果
引物 |
病例L1 |
病例L2 |
病例L3 |
PB*1 |
BM*2 |
PB |
BM |
PB |
BM |
Vβ3 |
poly*3 |
|
poly |
poly |
oligo |
oligo |
Vβ5 |
|
|
poly |
|
|
|
Vβ6 |
|
|
poly |
|
|
|
Vβ7 |
|
oligo*4 |
bi*5 |
|
|
|
Vβ9 |
|
|
poly |
|
|
poly |
注:*1:外周血,*2:骨髓,*3:多克隆,*4:寡克隆,*5:双克隆2.2 T细胞克隆性分析结果
基因扫描分析结果显示:Molt-4和Jurkat的Vβ2或Vβ8PCR产物均呈单峰图象(单克隆性);正常人的全部PCR产物呈多峰图象(多克隆性),2例肺鳞癌病人中,1例(L1)在骨髓中发现其Vβ7的PCR产物均呈一主峰及个别矮峰图象(寡克隆),另1例(L2)在外周血中其Vβ7的PCR产物呈双峰图象(双克隆),另1例肺腺癌的外周血和骨髓中的Vβ3PCR产物均呈寡克隆图象,其余的VβPCR产物均呈多峰图象(多克隆)(图1)。
图1基因扫描分析TCRVβ细胞克隆性结果
左图:病例L1骨髓中所存在的TCRVβ7家族T细胞,呈一主峰图像(寡克隆性)。
右图:病例L2外周血中所存在的5个TCRVβ亚家族的克隆性分布特点,
Vβ7呈双峰图像(双克隆性);余为多峰图像(多克隆性)。
3 讨论
本研究利用RT-PCR分别扩增3例NSCLC病人外周血和骨髓单个核细胞的TCRVβ24个亚家族基因,了解病人各Vβ亚家族T细胞的分布情况。结果显示病人的TCRVβ亚家族T细胞出现了明显的倾斜性,或称为选择性表达及优势利用的情况,根据细胞免疫学的基本原理,该结果应与病人存在某些特异性抗原(如肺癌细胞相关抗原等)所引起的刺激有关,另一方面,由于其它亚家族T细胞的减少,可能与肺癌病人部分细胞免疫功能缺陷有关。
用基因扫描对TCRVβ阳性的PCR产物进一步分析其均一性,即分析CDR3的长度,了解T细胞克隆性。结果显示,2例肺鳞癌病人的骨髓或外周血的Vβ7和1例肺腺癌病人的外周血和骨髓的Vβ3亚家族T细胞为寡克隆性或双克隆性T细胞,寡克隆T细胞提示在该Vβ亚家族中绝大部分的细胞都来自同一克隆,只有极小部分来自其他的克隆,双克隆是两个等位基因出现两种重排的结果,两者均提示该家族的T细胞为克隆性增殖的T细胞,这种克隆性增殖的T细胞可能是机体对肿瘤细胞相关抗原的一种直接反应,近期Echchakir等[8]有关肺癌组织中的TCRVβ亚家族分析也证明了这一点。
目前多数研究报道均未有明确提出哪种肿瘤与哪一个或哪些TCRVβ亚家族T细胞克隆有关。在同一种肿瘤的不同病例中出现的克隆性增殖T细胞不一定相同,并可能出现一个或多个TCRVβ亚家族T细胞克隆,其原因一方面由于病例数少,未能更好地发现其共性,另一方面,也可能与个体特异免疫和肿瘤的异质性有关[1,2,4,5]。值得注意的是2例肺鳞癌病人中有均同时出现Vβ7亚家族的克隆性增殖T细胞,提供了一定的趋向性,这些T细胞的真正功能有待积累病例做进一步的研究。
在黑色素瘤病人的研究中,Puisieux等[2]发现在同一病人的不同部位活检组织的TIL和不同时间的TIL表现相同的克隆性T细胞,提示这些克隆性增殖的细胞是对肿瘤相关抗原的免疫反应。Maccalli等[6]证明了表达某些TCRVβ的克隆性T细胞对自身肿瘤细胞的特异杀伤作用。最近Semino等[9]更发现Vβ3和Vβ7阳性的T细胞为自身肺癌细胞的特异性细胞溶解性淋巴细胞,为本研究的深入提供了可喜的证据。目前利用病人克隆性增殖T细胞作为特异性免疫治疗的研究已开展[7],但对肺癌的类似研究甚少。本研究在国内首先报道NSCLC克隆性增殖T细胞的情况,对这些克隆性增殖T细胞对肺癌特异性杀伤作用做深入的分析,是一项十分有意义的工作。
基金项目:本课题受卫生部科学研究基金(98-2-377)资助
通讯作者:吴一龙:Tel:86-20-87580159 Fax:86-20-87536401 E-mail:gzyilong@public.guangzhou.gd.cn
参考文献:
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收稿日期:1999-09-30
修稿日期:1999-11-08