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基因扫描分析非小细胞肺癌病人外周血和骨髓T细胞克隆性增殖及分布特点

基因扫描分析非小细胞肺癌病外周血和骨髓T细胞克隆性增殖及分布特点

癌症 2000年第3期第19卷 基础研究

作者:吴一龙 杨学宁 李锦添 王思愚

单位:吴一龙(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060);杨学宁(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060);李锦添(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060);王思愚(中山医科大学肺癌研究中心,广东广州510060)

关键词:T细胞受体;Vβ基因;T细胞克隆;非小细胞肺癌

  摘 要:目的:分析非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)病的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性增殖特点。方法:利用RTPCR和基因扫描方法分析3例NSCLC外周血和骨髓单个核细胞中24个TCRVβ基因的CDR3长度,了解TCRVβT细胞的分布及其克隆性。结果:3例病仅存在1~5个TCRVβ亚家族,主要为Vβ3、Vβ7和Vβ9,2例病出现Vβ7寡克隆性增殖T细胞,另1例发现Vβ3的寡克隆T细胞。结论:NSCLC病外周血或骨髓的TCRVβ亚家族出现倾斜性分布和克隆性增殖T细胞,主要为Vβ3和Vβ7亚家族T细胞,这可能是由肺癌细胞相关抗原引起的特异性免疫反应的T细胞克隆。

  分类号:R371.2;R734.2 文献标识码:A

  文章编号:1000-467X(2000)03-0204-04

The feature of clonal expansion and distribution of TCR VβT cells

  from peripheral blood and bone marrow in patients with NSCLC

WU Yi-long YANG Xue-ning LI Jin-tian et al.

  (Lung Cancer Research Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P.R.China )

  Abstract:Objective: To investigate the distribution and clonal expansion of TCR Vβ subfamily T cells in patients with non small cell lung cancer (NSCLC). Methods: The CDR3 size of TCR Vβ 24 subfamily genes were analyzed in peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from 3 cases with NSCLC using RT-PCR and genescan, to evaluate the distribution and clonality of TCR Vβ T cells. Results: Only 1~ 5 Vβ subfamily T cells could be identified in NSCLC cases, the Vβ subfamily T cells main expressed were Vβ 3, Vβ 7 and Vβ 9. Vβ 7 oligoclonal T cells were identified in two cases, whereas Vβ 3 oligoclonal T cells were detected in the other case. Conclusions: The skew distribution and clonal expansion of TCR Vβ subfamily T cells could be found on patients with NSCLC, predominantly in Vβ 3 and Vβ 7. It may be the T cell clones for specific immune response due to the lung cancer cells associated-antigen.

  Key wordsNSCLC; T cell receptor; Vβ gene; T cell clonality▲

  T细胞受体(Tcellsreceptor,TCR)是T细胞表面识别和结合抗原、参与特异性细胞免疫的重要分子。在T细胞发育过程中,其可变区(V)、多样区(D)和结合区(J)的基因片段进行重排,重排时在V-D,D-J区连接之间可有不同数量的核苷酸随机插入(N区),形成具有高度多样性的可变化区VβNNJβ,称为互补决定区(CDR3)[1]。同一克隆T细胞重排后,其CDR3长度和序列完全相同,而不同克隆T细胞的CDR3长度和序列有所不同,其长度的差别可为3~24个碱基,对CDR3长度和序列的分析,可以作为判别T细胞克隆性的指标[1]。利用RT-PCR和基因扫描方法分析TCRVβ24个亚家族的CDR3长度确定T细胞克隆性是国外近年开展的新方法[2],用于分析肿瘤病外周血或肿瘤组织浸润性T细胞中的克隆性增殖T细胞情况,借此深入了解机体对肿瘤细胞相关抗原的特异性反应情况[2,3]。本研究利用该方法分析3例NSCLC病外周血和骨髓TCRVβT细胞的分布及其克隆性。

  1 材料和方法

  1.1 样本

  经病理确诊的NSCLC病3例,其中肺鳞癌2例(L1、L2),肺腺癌1例(L3)。细胞株Molt-4和Jurkat作为单克隆对照,10例正常作为多克隆对照,B细胞株Raji作为阴性对照。骨髓取自手术中所切的部分肋骨,外周血和骨髓单个核细胞的分离按常规方法进行。

  1.2 RNA提取和cDNA合成

  RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco,BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(SuperscriptII,Gibco,BRL)反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。

  1.3 引物

  用于非标记PCR的24个Vβ引物和一Cβ引物,用于runoffreaction的5’端荧光素标记的Cβ-fam引物和用于序列分析的5’端生物素标记的Cβ-bio引物均由德国柏林TIBMOLBIOL公司合成。引物的核苷酸序列见表1[2,4]

表1 用于TCRVβPCR的引物的序列

Primer Sequence
Vβ1 5'-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC
Vβ2 5'-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA
Vβ3 5'-CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC
Vβ4 5'-TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA
Vβ5 5'-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC
Vβ6 5'-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG
Vβ7 5'-CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC
Vβ8 5'-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC
Vβ9 5'-TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC
Vβ10 5'-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC
Vβ11 5'-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA
Vβ12 5'-TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC
Vβ13 5'-CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA
Vβ14 5'-GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC
Vβ15 5'-CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG
Vβ16 5'-GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG
Vβ17 5'-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC
Vβ18 5'-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA
Vβ19 5'-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA
Vβ20 5'-AGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTC
Vβ21 5'-TCCAACCTGCAAGGCTTGACGACT
Vβ22 5'-AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA
Vβ23 5'-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA
Vβ24 5'-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC
5'-CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG
CβFam 5'-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG

  1.4 RT-PCR

  PCR按所报道的方法进行[2,4]。总反应体积为25μl,其中含1μlcDNA,任一Vβ引物(24个Vβ引物之一)和Cβ引物(0.5μmol),0.1mmoldNTP,1.25UTaq聚合酶(PerkinElmer)和1×PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪(PerkinElmer)中进行。共进行40循环,每一循环包括:94℃、1min(首次3min),60℃、1min和72℃、1min(末次10min),PCR产物保存于4℃中备用。

  1.5 T细胞克隆性分析

  1.5.1 Runoffreactions(标记PCR产物):10μl的反应体系含2μl的未标记的PCR产物、0.1μMCβfam引物、3mmolMgCl2,0.2mmoldNTP,0.25UTaq聚合酶和PCR缓冲液(PerkinElmer)。PCR共进行35循环,退火温度为66℃,余同上[4]

  1.5.2 基因扫描分析(CDR3长度分析):有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的PCR产物(2μl)加入2.5μl甲酰胺,0.5μlGenescan-500Tamra分子量标准品(ABI,PerkinElmer)和0.5μl加样缓冲液(Dextran50mg/ml,EDTA25mmol,Genescan-500TamraKit),经94℃、4min变性后,于6%聚丙酰胺凝胶中电泳,经373ADNA序列仪(ABI,PerkinElmer)的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光素强度。

  1.5.3 结果判定:由于Vβ和Cβ引物是固定的,故Vβ/Cβ所扩增的PCR产物的大小决定于Vβ-Dβ、Dβ-Jβ之间重排时的连接片段N区和Dβ的长短,即VβNDβNJβ(CDR3),不同的T细胞克隆的PCR产物长度和含量有所不同,通过PCR产物的状况,便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过基因扫描软件分析,电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量;峰的形态提示产物的均一性(克隆性),当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时,电泳时,其迁移率完全相同,故在同一时间点通过扫描探头,所显示的结果为一单峰图象,提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞,即单克隆的细胞;而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性;而多峰图象提示多克隆性[4,5]2 结果

  2.1 TCRVβ亚家族T细胞的表达情况

  RT-PCR扩增结果:3例病外周血和骨髓分别存在1~5个Vβ亚家族(表2),正常表达所有的24个TCRVβ亚家族,Molt-4和Jurkat细胞则均为表达单一TCRVβ的T细胞,分别为Vβ2和Vβ8T细胞。B细胞株Raji不表达任何TCRVβ基因。

表2 RT-PCR和基因扫描分析TCRVβ亚家族

  T细胞克隆性的结果

引物 病例L1 病例L2 病例L3
PB*1 BM*2 PB BM PB BM
Vβ3 poly*3   poly poly oligo oligo
Vβ5     poly      
Vβ6     poly      
Vβ7   oligo*4 bi*5      
Vβ9     poly     poly

  注:*1:外周血,*2:骨髓,*3:多克隆,*4:寡克隆,*5:双克隆2.2 T细胞克隆性分析结果

  基因扫描分析结果显示:Molt-4和Jurkat的Vβ2或Vβ8PCR产物均呈单峰图象(单克隆性);正常的全部PCR产物呈多峰图象(多克隆性),2例肺鳞癌病中,1例(L1)在骨髓中发现其Vβ7的PCR产物均呈一主峰及个别矮峰图象(寡克隆),另1例(L2)在外周血中其Vβ7的PCR产物呈双峰图象(双克隆),另1例肺腺癌的外周血和骨髓中的Vβ3PCR产物均呈寡克隆图象,其余的VβPCR产物均呈多峰图象(多克隆)(图1)。

图1基因扫描分析TCRVβ细胞克隆性结果

  左图:病例L1骨髓中所存在的TCRVβ7家族T细胞,呈一主峰图像(寡克隆性)。

  右图:病例L2外周血中所存在的5个TCRVβ亚家族的克隆性分布特点,

  Vβ7呈双峰图像(双克隆性);余为多峰图像(多克隆性)。

  3 讨论

  本研究利用RT-PCR分别扩增3例NSCLC病外周血和骨髓单个核细胞的TCRVβ24个亚家族基因,了解病各Vβ亚家族T细胞的分布情况。结果显示病的TCRVβ亚家族T细胞出现了明显的倾斜性,或称为选择性表达及优势利用的情况,根据细胞免疫学的基本原理,该结果应与病存在某些特异性抗原(如肺癌细胞相关抗原等)所引起的刺激有关,另一方面,由于其它亚家族T细胞的减少,可能与肺癌病部分细胞免疫功能缺陷有关。

  用基因扫描对TCRVβ阳性的PCR产物进一步分析其均一性,即分析CDR3的长度,了解T细胞克隆性。结果显示,2例肺鳞癌病的骨髓或外周血的Vβ7和1例肺腺癌病的外周血和骨髓的Vβ3亚家族T细胞为寡克隆性或双克隆性T细胞,寡克隆T细胞提示在该Vβ亚家族中绝大部分的细胞都来自同一克隆,只有极小部分来自其他的克隆,双克隆是两个等位基因出现两种重排的结果,两者均提示该家族的T细胞为克隆性增殖的T细胞,这种克隆性增殖的T细胞可能是机体对肿瘤细胞相关抗原的一种直接反应,近期Echchakir等[8]有关肺癌组织中的TCRVβ亚家族分析也证明了这一点。

  目前多数研究报道均未有明确提出哪种肿瘤与哪一个或哪些TCRVβ亚家族T细胞克隆有关。在同一种肿瘤的不同病例中出现的克隆性增殖T细胞不一定相同,并可能出现一个或多个TCRVβ亚家族T细胞克隆,其原因一方面由于病例数少,未能更好地发现其共性,另一方面,也可能与个体特异免疫和肿瘤的异质性有关[1,2,4,5]。值得注意的是2例肺鳞癌病中有均同时出现Vβ7亚家族的克隆性增殖T细胞,提供了一定的趋向性,这些T细胞的真正功能有待积累病例做进一步的研究。

  在黑色素瘤病的研究中,Puisieux等[2]发现在同一病的不同部位活检组织的TIL和不同时间的TIL表现相同的克隆性T细胞,提示这些克隆性增殖的细胞是对肿瘤相关抗原的免疫反应。Maccalli等[6]证明了表达某些TCRVβ的克隆性T细胞对自身肿瘤细胞的特异杀伤作用。最近Semino等[9]更发现Vβ3和Vβ7阳性的T细胞为自身肺癌细胞的特异性细胞溶解性淋巴细胞,为本研究的深入提供了可喜的证据。目前利用病克隆性增殖T细胞作为特异性免疫治疗的研究已开展[7],但对肺癌的类似研究甚少。本研究在国内首先报道NSCLC克隆性增殖T细胞的情况,对这些克隆性增殖T细胞对肺癌特异性杀伤作用做深入的分析,是一项十分有意义的工作。

  基金项目:本课题受卫生部科学研究基金(98-2-377)资助

  通讯作者:吴一龙:Tel:86-20-87580159 Fax:86-20-87536401 E-mail:gzyilong@public.guangzhou.gd.cn

  参考文献:

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收稿日期:1999-09-30

修稿日期:1999-11-08


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